دستورالعمل تهیه و آماده سازی AVV پلاسمیدها | AAV Plasmids

پلاسمید‌های AAV به مولکول‌های DNA اشاره دارند که دارای توالی‌های مشتق شده از آدنو ویروس هستند و به عنوان وکتورهایی برای انتقال و بیان ژن در برنامه‌های تحقیقاتی و درمانی استفاده می‌شوند. پلاسمید یک مولکول کوچک و دایره‌ای از DNA است که می‌تواند به طور مستقل در داخل یک سلول میزبان تکثیر شود.

در زمینه پلاسمید‌های AAV، این ساختارهای DNA به طور ویژه برای حمل اطلاعات ژنتیکی خاصی طراحی می‌شوند، مانند یک ژن درمانی، یک ژن گزارشگر یا عناصر تنظیمی، به سلول‌های هدف. AAV به عنوان یک انتخاب محبوب برای ایجاد وکتورهای انتقال ژن به دلیل توانایی انتقال کارآمد به سلول‌های تقسیم شونده و غیر تقسیم شونده، کم‌ترین ایمونوژنسیته و قابلیت ادغام در ژنوم سلول میزبان یا وجود به صورت اپیزوم را دارا می‌باشند.

ویژگی‌های کلیدی پلاسمید‌های AAV شامل:

• منشأ تکثیر: منطقه‌ای از پلاسمید که به طور مستقل در داخل سلول میزبان تکثیر می‌شود
• تکرارهای معکوس نوکلئوتیدهای آدنو(ITRs): ین توالی‌ها مشتق از AAV هستند که ژنوم وراثتی را احاطه می‌کنند. آنها برای تکثیر، بسته‌بندی و ادغام AAV ضروری هستند
• کاست ژنتیکی: شامل ژن منتخب (به عنوان مثال، یک ژن درمانی) به همراه عناصر تنظیمی ضروری مانند پروموترها، تقویت‌کننده‌ها و ترمیناتورها می‌شود.
• سیگنال مرتبط با بسته بندی کردن ویروس (Ψ): یک توالی سیگنالی که به قسمت بسته بندی کننده نشان می‌دهد که ژنوم AAV را به داخل کپسیدهای ویروسی بسته‌بندی کند.
• مارکر انتخابی: ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک یا مارکر قابل انتخاب دیگر معمولاً برای شناسایی و انتخاب سلول‌هایی که پلاسمید را دریافت کرده‌اند، به کار می‌روند.
• عناصر کنترل بیان: این عناصر بیان ژن را تنظیم می‌کنند و زمانبندی و سطح بیان ژن را به درستی اطمینان می‌دهند.

پلاسمید‌های AAV معمولاً به همراه پلاسمید‌های کمکی و خطوط سلولی بسته‌بندی استفاده می‌شوند تا از طریق یک سیستم بسته‌بندی بدون ویروس کمکی، حامل‌های AAV کارآمدی تولید شوند. این حامل‌ها سپس برای درمان ژنی، ویرایش ژن و مختلف کاربردهای دیگر در بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی استفاده می‌شوند. طراحی پلاسمید‌های AAV و عناصر خاص در آنها بسته به استفاده موردنظر و سلول‌های هدف انتقال ژن وابسته به طراحی است.

طراحی پلاسمید‌های AAVشامل چندین جزء کلیدی است:

• ژن وراثتی: ژن وراثتی که می‌خواهید به سلول‌های هدف انتقال دهید. این ممکن است یک ژن درمانی، یک ژن گزارشگر (برای پیگیری بیان ژن) یا هر ژن دیگری برای مقاصد آزمایشی باشد.
• پروموتر: پروموتر عنصر تنظیمی است که برای بیان ژن وراثتی استفاده می‌شود. پروموترهای مختلف می‌توانند ویژگی‌ها و سطح بیان ژن را کنترل کنند.
• تقویت‌کننده: تقویت‌کننده‌ها توالی‌های DNA هستند که می‌توانند فعالیت پروموترها را افزایش دهند و منجر به بیان بیشتر ژن‌ها شوند.
• ترمیناتور: ترتیمناتور توالی‌ای است که پایان ترانسکریپت ژن را نشان می‌دهد. این تضمین می‌کند که ژن وراثتی به درستی بیان می‌شود و از مداخله با ژن‌های مجاور جلوگیری می‌کند.
• تکرارهای معکوس نوکلئوتیدهای آدنو(ITRs): این توالی‌ها برای بیولوژی AAV بسیار مهم هستند. آنها از ژنوم AAV استخراج شده‌اند و برای بسته‌بندی ویروسی AAV به داخل کپسیدها، و همچنین برای ادغام و تکثیر ضروری هستند.
• مارکر بسته‌بندی (Ψ): این توالی به ماشین آلات بسته‌بندی AAV نشان می‌دهد که ژنوم از چه منطقه ای شروع می‌شود و پایان می‌یابد. این مارکر برای بسته‌بندی صحیح ژنوم AAV حائز اهمیت است.
• نشانه‌گذاری‌کننده‌ها: این نشانه‌گذارها، که معمولاً ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک هستند، به تشخیص سلول‌هایی که پلاسمید AAV را تاخذ کرده‌اند، کمک می‌کنند و در شناسایی و حفظ سلول‌هایی که ژن وراثتی را دریافت کرده‌اند، مؤثر هستند.

به طور خلاصه، پلاسمید‌های AAV نقش کلیدی در تولید حامل‌های AAV برای کاربردهای مختلف در درمان ژنی، ویرایش ژن، ژنومیک عملکردی و تحقیقات بیماری ایفا می‌کنند. طراحی دقیق آنها به محققان امکان می‌دهد ژن‌های وراثتی را به سلول‌ها یا بافت‌های خاص منتقل کنند و امکانات جدیدی برای درک فرآیندهای زیستی و توسعه درمان‌های نوآورانه را به ارمغان می‌آورد.

یکی از روش های تهیه و آماده سازی پلاسمیدهای AVV:

1. آمپی سیلین را به 1 لیتر آبگوشت عالی (TB) (غلظت نهایی 100 میکروگرم بر میلی لیتر) اضافه کنید.
2. تلقیح با 1-3 میلی لیتر از کشت باکتریایی (سلول های فوق العاده SURE 2 تبدیل شده با پلاسمید AAV).
3. 1 لیتر از کشت باکتری را به مدت 24 ساعت در یک فلاسک اتوکلاو شده 4 لیتری با تکان دادن و هوادهی مداوم در دمای 37 درجه سانتیگراد پرورش دهید.
4. با استفاده از کیت پلاسمید طبق دستورالعمل سازنده، پلاسمیدها را جدا کنید.