توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing

توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing

سرویس توالی‌یابی RNAهای طولانی غیرکدکننده یک روش گسترده نسل بعدی برای شناسایی رونوشت‌های کدکننده غیرپروتئینی با طول بیش از 200 نوکلئوتید است. lncRNA بیان ژن‌های کدکننده از جمله وراثت اپی‌ژنتیک، پلی آدنیلاسیون، پیوند، پیش رونویسی، رونویسی و پس از رونویسی را تنظیم می‌کند. در مقایسه با mRNA، lncRNA به طور کلی کم بیان است و ویژگی بافتی قوی تری دارد. فناوری توالی یابی با توان بالای lncRNA همراه با تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک می‌تواند کمیت و غنی سازی عملکرد رونوشت‌های هدف، جهت‌گیری رشته و روابط تنظیمی آنها را نشان دهد.

تصور می‌شود که RNA‌های طولانی غیرکدکننده نزدیک به 30000 رونوشت مختلف در انسان را در بر می‌گیرند، از این رو رونوشت‌های lncRNA بخش عمده‌ای از رونوشت‌های غیرکدکننده را تشکیل می‌دهند. کشف lncRNA هنوز در مراحل اولیه است و تنها بخش کوچکی از lncRNA ها تاکنون بررسی شده است. اگرچه می‌توانیم دسته‌بندی انواع مختلف توابع lncRNA را آغاز کنیم، اما هنوز با توانایی پیش‌بینی عملکرد lncRNA‌های جدید فاصله داریم. توالی یابی lncRNA (lncRNA-seq) یک ابزار قدرتمند NGS برای مطالعه نقش های عملکردی در فرآیندهای مختلف بیولوژیکی و بیماری های انسانی، مانند سرطان و اختلالات عصبی است.

برای توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing توان عملیاتی و دقت بالا همراه با مقادیر RNA اولیه پایین مورد نیاز می‌باشد. متفاوت از بررسی تراشه سنتی، تجزیه و تحلیل lncRNA همراه با فناوری توالی یابی با توان بالا و تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک می تواند به طور جامع اطلاعات lncRNA را در نمونه ها بررسی کند.

روش کار توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing

یک توالی یابی معمولی lncRNA شامل ارزیابی کیفیت RNA کل، آماده سازی کتابخانه و تعیین توالی است. از نمونه RNA تا داده های نهایی، هر مرحله بر کیفیت و کمیت داده ها تأثیر دارد. بنابراین، به دست آوردن داده های با کیفیت بالا، پیش فرض اطمینان از تجزیه و تحلیل اطلاعات بیولوژیکی جامع و معتبر است.

(1) تشخیص RNA کل

این مرحله عمدتا شامل تجزیه و تحلیل درجه تخریب RNA و آلودگی، تشخیص خلوص RNA  نسبت (OD260/280)، تعیین کمیت دقیق غلظت RNA  و تشخیص یکپارچگی RNA است.

(2) ساخت کتابخانه

پس از اینکه RNA کل برای آماده‌سازی کتابخانه واجد شرایط شد، غنی‌سازی mRNA مبتنی بر poly-A به دنبال قطعه‌بندی mRNA برای کاهش خواندن rRNA انجام می‌شود. سپس cDNA از RNA غنی شده و قطعه قطعه شده با استفاده از رونوشت معکوس ((Super-Script II و پرایمرهای تصادفی سنتز می شود. cDNA با استفاده از محلول بافر، dNTPs dUTP، dATP، dGTP و dCTP  و پلیمراز به DNA دو رشته‌ای تبدیل شد. قطعات cDNA در انتها بازیابی شده و به آداپتورهای مخصوص پلت فرم متصل می شوند.

(3) تشخیص و توالی کتابخانه جهت توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing

پس از ساخت کتابخانه، کمی سازی اولیه و رقیق سازی انجام می‌شود و سپس اندازه قطعه کتابخانه آزمایش می‌شود. توالی یابی Hiseq/Miseq پس از بازرسی کتابخانه انجام می شود.

تجزیه و تحلیل داده های توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing

پس از اینکه قرائت‌های خام RNA-seq توسط توالی‌یابی زوجی Illumina تولید شد، تجزیه و تحلیل داده‌ها و شناسایی lncRNA‌ها به شرح زیر فهرست می‌شوند.

(1) پیش پردازش داده ها

ارزیابی کیفی. پس از به دست آوردن داده های خام فایل های (fastq)، کیفیت خواندنش‌های اصلی شامل توزیع نرخ خطای توالی و توزیع محتوای GC، با استفاده از نرم‌افزار خاص ارزیابی می شود.

فیلتر کردن داده های سکانس های توالی اصلی حاوی خواندنش‌های با کیفیت پایین و دنباله‌های آداپتور هستند. برای اطمینان از کیفیت تجزیه و تحلیل داده‌ها، خوانش‌های خام باید فیلتر شوند تا خوانش‌های تمیز به دست آید، و تجزیه و تحلیل بعدی بر اساس خوانش تمیز انجام می‌شود. فیلتر داده‌ها عمدتاً شامل حذف دنباله‌های آداپتور در خوانش‌ها، حذف خوانش‌هایی با نسبت بالای N ( N نشان‌دهنده اطلاعات پایه نامشخص است ) و حذف خوانش‌های با کیفیت پایین است.

(2) ارزیابی کیفیت کلی RNA-seq

عمدتاً شامل ارزیابی همبستگی بین نمونه ای (ضریب همبستگی پیرسون) و ارزیابی توزیع یکنواخت است.

(3) خواندن تراز با ژنوم مرجع

اگر ژنوم مرجع به درستی انتخاب شود و هیچ آلودگی در آزمایش‌ها وجود نداشته باشد، نتایج نقشه‌برداری (کل نقشه‌برداری‌ها یا قطعات) معمولاً بالاتر از ۷۰ درصد خواهد بود.

(4) کاوش داده ها

پس از مرتب سازی فایل ها، نتایج خروجی را می توان برای تجزیه و تحلیل خوشه ای و تجزیه و تحلیل PCA  (تجزیه و تحلیل اجزای اصلی) در بین نمونه های RNA-seq استفاده کرد، و رابطه بین نمونه ها را می توان بررسی کرد یا طراحی آزمایشی را می‌توان تأیید کرد. هر چه فاصله خوشه‌بندی نمونه یا فاصله PCA نزدیک‌تر باشد، نمونه مشابه‌تر است.

(5) مونتاژ رونوشت ها

رونوشت ها با نرم افزار مونتاژ می شوند. نرم افزارها از مدل احتمال برای جمع‌آوری و کمی کردن سطح بیان مجموعه ایزوفرم تا حد ممکن کوچکتر در همان زمان استفاده کرده. برای ارائه حداکثر احتمال توضیح داده‌های بیان در نقطه نقشه‌برداری، و ارائه اطلاعات زنجیره به طور دقیق با پارامترهای خاص برای کتابخانه خاص زنجیره ای از نرم افزاری که مبتنی بر مدل تقسیم‌بندی آماری است استفاده کرده تا بین مکان‌های بیان و نویز پس‌زمینه تجربی تمایز قائل شود، اطلاعاتی در مورد تمام ایزوفرم‌ها با بیان آماری معنی‌دار در محل نقشه‌برداری فراهم کرده د و برای مونتاژ رونوشت‌های طولانی قابل استفاده باشد.

(6) غربالگری lncRNA کاندید

غربالگری اولیه شامل سه مرحله است: ابتدا رونوشت هایی که طول آن ها بیشتر از 200 جفت باز و تعداد اگزون ها بیشتر از 2 است، انتخاب می شوند. سپس، پوشش هر رونوشت توسط دکمه سر دست محاسبه می شود و رونوشت هایی با حداقل پوشش خواندن بیشتر از 3 انتخاب می شوند. در نهایت، غیرlncRNA ها با مقایسه با غیرlncRNA شناخته شده فیلتر می شوند و نتایج برای غربالگری موقعیت استفاده می شود.

(7) تجزیه و تحلیل بیان در توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing

این مرحله عمدتا شامل مقایسه سطح بیان، تجزیه و تحلیل بیان افتراقی، و غربالگری lncRNA بیان دیفرانسیل، تجزیه و تحلیل خوشه بیان lncRNA و تجزیه و تحلیل خاص بافت یا فنوتیپی است.

(8) تجزیه و تحلیل پیشرفته توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing

پیش‌بینی ژن هدف LncRNA: عملکرد lncRNA مربوط به ژن پروتئین کد کننده مجاور است. ژن‌های کدکننده پروتئین مجاور lncRNA برای تجزیه و تحلیل غنی‌سازی عملکردی شناسایی می‌شوند و عملکرد اصلی lncRNA را می‌توان در lncRNATargets پیش‌بینی کرد.

تجزیه و تحلیل غنی سازی عملکردی lncRNA خاص: lncRNA اختصاصی به طور کلی به lncRNA با بیان متفاوت یا بافت یا بیان خاص فنوتیپی اشاره دارد. تجزیه و تحلیل غنی سازی عملکردی این lncRNA های خاص توسط GO و KEEG می تواند به ترتیب انجام شود.

تجزیه و تحلیل تعامل. LncRNA و mRNA را می توان از طریق رابطه هدف گیری مرتبط کرد و mRNA را می توان با پروتئین مرتبط کرد، بنابراین شبکه تعامل lncRNA-mRNA-پروتئین را تشکیل می دهد.

توالی یابی آر ان ای بلند غیر کد شونده | lncRNA-Sequencing