توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

شرایط و نحوه ارسال نمونه

1. طبق توضیحات بالا نمونه خود را ثبت کنید.

2. جهت ارسال نمونه و پرایمر از میکروتیوب ۰/۲ استفاده نمائید و از ارسال نمونه با میکروتیوب ۰/۵ و ۱.۵ اجتناب شود. از بسته شدن کامل درب اطمینان حاصل نمایید، اطراف میکروتیوب را با پارافیلم پوشانده و در داخل زیپ کیپ جداگانه قرار دهید.
3. مشخصات نمونه را(نهایتا چهار حرف لاتین بزرگ) بطور خوانا توسط ماژیک آبی یا مشکی ضدآب مطابق با اطلاعات وارد شده به سایت روی هریک از نمونه ها بنویسید (جهت نگهداری از اطلاعات روی بدنه میکروتیوب ها از نوار چسب استفاده کنید).

4. توجه داشته باشید، روی تیوب ها فقط نام نمونه قید شود. سعی کنید طول تعداد کلمات بیشتر از ۴ کاراکتر نباشد. از بکاربردن عبارات فارسی خودداری نمایید.
5. برای دستیابی به نتیجه بهتر در تعیین توالی،نمونه ارسالی باید کاملا” خالص باشد نمونه نباید دارای باند غیر اختصاصی و یا اسمیر باشد.در صورت نیاز به تخلیص، گزینه تخلیص در هنگام ثبت در سایت را فعال کنید. تصویر زیر مثالی از نمونه های مناسب و قابل پذیرش است. در صورتی که نسبت به کیفیت نمونه مردد هستید تصویر ژل الکتروفورز خود را به ادرس ایمیل kiagenefa@gmail.com ارسال نموده و از کارشناسان شرکت مشورت بگیرید.

Sanger sequencing

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

حجم و غلظت مورد نیاز جهت ارسال نمونه و پرایمر

1. حداقل ۳۰ و حداکثر ۵۰ میکرولیتر از نمونه را در ویال ۰/۲ اضافه کنید غلظت نمونه ها حداقل 150 نانوگرم باشد.

2. در صورتی که نمونه ارسالی نیاز به خالص سازی داشته باشد حداقل حجم نمونه مورد نیاز به حدود ۵۰  میکرولیتر افزایش می یابد و غلظت نمونه تخلیص شده بستگی به طول قطعه و کیفیت نمونه دارد.
3. حداقل حجم پرایمر مورد قبول ۱۰ میکرولیتر با غلظت ۱۰ پیکو مول می باشد.

4.نمونه ها پس از آماده سازی، به آدرس تهران،بزرگراه حکیم( همدانی) بعداز تونل غزه، بلوار پژوهش جنوبی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری شرکت کیاژن ارسال شوند . حتما بسته ارسالی دارای نام و نام خانوادگی شماره تلفن و ایمیل و شماره سفارش باشد.

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

برخی عوامل بروز خطا در توالی یابی سنگر

فردریک سانگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ روش توالی‌یابی سانگر را بر پایه خاتمه دادن رشته دی اکسی نوكلئوتيد توسط DNA پلی مراز در فرآیند همانندسازی DNA   ابداع کردند و به دلیل این اختراع در سال 1980 جایزه نوبل شیمی را به خود اختصاص دادند. بعدها این تکنیک توسط شرکت Applied Bio systems بصورت تجاری درآمد. این روش برای تقریباً 40 سال از مهم ترین روش های تعیین توالی DNA  بوده است. اخیراً روش توالی‌یابی دیگری به نام «Next Generation Sequencing » برای  بررسی نواحی بزگتری از ژنوم با صرف زمان کوتاهتر و در بعد گسترده تری  مورد استفاده قرار گرفته است. با این وجود، توالی‌یابی سانگر همچنان برای بررسی نواحی کوچکتر ژنوم و یا تایید نتایج حاصل از توالی یابی NGS از اهمیت قابل توجهی برخوردار است.

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

توالی یابی DNA  با استفاده از روش   Sanger Sequencing

مبنای این تکنیک استفاده از نوکلئوتیدهای ویژه ddNTP ) ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)  است که فاقد گروه OH  بر روی کربن ʹ3 خود می باشند. به این نوکلئوتید ها خاتمه دهنده برگشت ناپذیر همانندسازی گفته می شود که با رنگ فلورسانس نشان دار شده اند. در روش توالی یابی سانگر، به ازای یک به ده از این ddNTP ها در مقابل نوکلئوتید های معمولی ( dNTP) در سنتز DNA استفاده می شود.

در روش توالی یابی سانگر فقط نوکلئوتیدهای ddNTP نشان دار به مجموعه مواد مورد نیاز برای همانندسازی، اضافه شده اند و بقیه مسیر با همان روش مرسوم Cycle-Sequencing (با دستگاه ترموسایکلر و آغاز تک رشته ای شدن DNAژنومی) آغاز می گردد. با توجه به توالی DNA نوکلئوتیدها یکی یکی به رشته اضافه می گردند همانگونه که در بالا ذکر گردید، در صورتی که dNTP به رشته در حال همانندسازی اضافه گردد رشته طویل تر شده و اگر ddNTP بجای  dNTP به این رشته در حال تکثیر اضافه گردد، خاتمه زنجیره رخ می دهد.

بدین صورت قطعاتی با طول های متفاوت که در انتها نشان دار شده اند خواهیم داشت. این قطعات براساس سایز بر روی ژل الکتروفورز در دستگاه Genetic Analyzer قرار می گیرند و با توجه به اینکه سبک ترین قطعات با سرعت بیشتری به پایین ژل هدایت می شوند در نتیجه خوانش نوکلئوتیدها از پایین ترین قطعات ژل صورت می پذیرد. برای روشن تر شدن این مطالب این مراحل بصورت شماتیک در ذیل آورده شده است:

سپس، فرآیند خوانش قطعات تکثیر شده، توسط دستگاه صورت میگیرد.

و در نهایت توالی مورد بررسی به شکل زیر در نرم افزار کروماس جهت آنالیز در اختیار کارشناس قرار داده می شود.

متاسفانه در برخی مواقع نتایج حاصل از تعیین توالی DNA رضایت بخش نمی باشد، مهم ترین مشکلات مشاهده شده شامل؛

۱.خوانش صورت نگیرد ( Failed sequence  ) ؛

۲.پیک های کوتاه و ضعیف مشاهده گردد (Weak sequence) ؛