توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencingتوالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

جهت توالی یابی سنگر به نکات زیر توجه کنید

1.جهت ثبت درخواست خدمات توالی یابی نمونه ها به شیوه سنگر، فرم اکسل زیر را دانلود و پر کنید به همراه تصاویر ژل الکتروفورز تمامی نمونه ها در یک ایمیل به آدرس Kiagenefa@gmail.com ارسال بفرمایید.

2.پس از ارسال (فرم اکسل + تصاویر ژل الکتروفورز) پیش فاکتور توسط کارشناسان کیاژن جهت پرداخت به ایمیل شما ارسال خواهد شد پس از پرداخت هزینه، نمونه های مربوطه را به ادرس شرکت ارسال بفرمایید.

3.جهت آماده سازی نمونه به توضیحات پایین تر همین صفحه مراجعه کنید.

4.دیتای توالی یابی انجام شده  دو الی سه هفته پس از ارسال به کمپانی سکانس کننده به ایمیل شما ارسال خواهد شد.

5.فاکتور به نشانی شما با دریافت هزینه پست یا پیک ارسال می شود.

تماس بگیرید

تحویل اکسپرس
پشتیبانی 24 ساعته
پرداخت در محل
7 روز ضمانت بازگشت
ضمانت اصل بودن کالا

توضیحات محصول

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

شرایط و نحوه ارسال نمونه

1. طبق توضیحات بالا فایل اکسل به همراه تصاویر ژل را ارسال کنید.

2. جهت ارسال نمونه و پرایمر از میکروتیوب ۰/۲ استفاده نمائید و از ارسال نمونه با میکروتیوب ۰/۵ و ۱.۵ اجتناب شود. از بسته شدن کامل درب اطمینان حاصل نمایید، اطراف میکروتیوب را با پارافیلم پوشانده و در داخل زیپ کیپ جداگانه قرار دهید.
3. مشخصات نمونه را(نهایتا چهار حرف لاتین بزرگ) بطور خوانا توسط ماژیک آبی یا مشکی ضدآب مطابق با اطلاعات وارد شده به سایت روی هریک از نمونه ها بنویسید (جهت نگهداری از اطلاعات روی بدنه میکروتیوب ها از نوار چسب استفاده کنید).

4. توجه داشته باشید، روی تیوب ها فقط نام نمونه قید شود. سعی کنید طول تعداد کلمات بیشتر از ۴ کاراکتر نباشد. از بکاربردن عبارات فارسی خودداری نمایید.
5. برای دستیابی به نتیجه بهتر در تعیین توالی،نمونه ارسالی باید کاملا” خالص باشد نمونه نباید دارای باند غیر اختصاصی و یا اسمیر باشد.در صورت نیاز به تخلیص، گزینه تخلیص در هنگام ثبت در سایت را فعال کنید. تصویر زیر مثالی از نمونه های مناسب و قابل پذیرش است.

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

حجم و غلظت مورد نیاز جهت ارسال نمونه و پرایمر

1.حداقل حجم پرایمر مورد نیاز به ازاي 1 تا 5 خوانش ۱۵-۲۰ میکرولیتر با غلظت ۱۰ پیکو مول می باشد.

2. حداقل ۲۰ و حداکثر ۵۰ میکرولیتر از نمونه را در ویال ۰/۲ اضافه کنید غلظت نمونه ها برای پلاسمید حداقل ۲۰۰-۳۰۰ نانوگرم در هر میکرولیتر و برای محصول PCR حداقل حدود ۵۰ نانوگرم در هر میکرولیتر باشد.

3. در صورتی که نمونه ارسالی نیاز به خالص سازی داشته باشد حداقل حجم نمونه مورد نیاز به حدود ۵۰  میکرولیتر افزایش می یابد و غلظت نمونه تخلیص شده بستگی به طول قطعه و کیفیت نمونه دارد.

4.نمونه ها پس از آماده سازی، به آدرس تهران،بزرگراه حکیم( همدانی) بعداز تونل غزه، بلوار پژوهش جنوبی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری شرکت کیاژن ارسال شوند . حتما بسته ارسالی دارای نام و نام خانوادگی و شماره تلفن باشد.

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

برخی عوامل بروز خطا در توالی یابی سنگر

فردریک سانگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ روش توالی‌یابی سانگر را بر پایه خاتمه دادن رشته دی اکسی نوكلئوتيد توسط DNA پلی مراز در فرآیند همانندسازی DNA   ابداع کردند و به دلیل این اختراع در سال 1980 جایزه نوبل شیمی را به خود اختصاص دادند. بعدها این تکنیک توسط شرکت Applied Bio systems بصورت تجاری درآمد. این روش برای تقریباً 40 سال از مهم ترین روش های تعیین توالی DNA  بوده است. اخیراً روش توالی‌یابی دیگری به نام «Next Generation Sequencing » برای  بررسی نواحی بزگتری از ژنوم با صرف زمان کوتاهتر و در بعد گسترده تری  مورد استفاده قرار گرفته است. با این وجود، توالی‌یابی سانگر همچنان برای بررسی نواحی کوچکتر ژنوم و یا تایید نتایج حاصل از توالی یابی NGS از اهمیت قابل توجهی برخوردار است.

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

توالی یابی DNA  با استفاده از روش   Sanger Sequencing

مبنای این تکنیک استفاده از نوکلئوتیدهای ویژه ddNTP ) ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)  است که فاقد گروه OH  بر روی کربن ʹ3 خود می باشند. به این نوکلئوتید ها خاتمه دهنده برگشت ناپذیر همانندسازی گفته می شود که با رنگ فلورسانس نشان دار شده اند. در روش توالی یابی سانگر، به ازای یک به ده از این ddNTP ها در مقابل نوکلئوتید های معمولی ( dNTP) در سنتز DNA استفاده می شود.

در روش توالی یابی سانگر فقط نوکلئوتیدهای ddNTP نشان دار به مجموعه مواد مورد نیاز برای همانندسازی، اضافه شده اند و بقیه مسیر با همان روش مرسوم Cycle-Sequencing (با دستگاه ترموسایکلر و آغاز تک رشته ای شدن DNAژنومی) آغاز می گردد. با توجه به توالی DNA نوکلئوتیدها یکی یکی به رشته اضافه می گردند همانگونه که در بالا ذکر گردید، در صورتی که dNTP به رشته در حال همانندسازی اضافه گردد رشته طویل تر شده و اگر ddNTP بجای  dNTP به این رشته در حال تکثیر اضافه گردد، خاتمه زنجیره رخ می دهد.

بدین صورت قطعاتی با طول های متفاوت که در انتها نشان دار شده اند خواهیم داشت. این قطعات براساس سایز بر روی ژل الکتروفورز در دستگاه Genetic Analyzer قرار می گیرند و با توجه به اینکه سبک ترین قطعات با سرعت بیشتری به پایین ژل هدایت می شوند در نتیجه خوانش نوکلئوتیدها از پایین ترین قطعات ژل صورت می پذیرد. برای روشن تر شدن این مطالب این مراحل بصورت شماتیک در ذیل آورده شده است:

سپس، فرآیند خوانش قطعات تکثیر شده، توسط دستگاه صورت میگیرد.

و در نهایت توالی مورد بررسی به شکل زیر در نرم افزار کروماس جهت آنالیز در اختیار کارشناس قرار داده می شود.

متاسفانه در برخی مواقع نتایج حاصل از تعیین توالی DNA رضایت بخش نمی باشد، مهم ترین مشکلات مشاهده شده شامل؛

۱.خوانش صورت نگیرد ( Failed sequence  ) ؛

دلیل بروز مشکل راه حل
*جایگاه اتصال برای پرایمر وجود نداشته است

*تکثیر غیراختصاصی و وجود باندهای اضافی در ژل

*انتقال مجدد پرایمر به شرکت
*کیفیت DNA در واکنش PCR  پایین بوده است

*میزان DNA مورد استفاده ناکافی بوده است

*تخلیص مجدد DNA

* بررسی کیبفیت DNA با استفاده از نانو دراپ و انجام PCR

*وجود آلودگی های مهارکننده در نمونه شامل فنول، اتانول و EDTA *پاکسازی (  Purification  ) نمونه DNA از آلودگی ها
*شرایط زنجیره سرد پرایمرها در موقع انتقال به آزمایشگاه رعایت نشده باشد *انتقال مجدد پرایمر به شرکت
امکان مشاوره علمی رایگان توسط کارشناسان شرکت کیاژن وجود دارد

۲.پیک های کوتاه و ضعیف مشاهده گردد (Weak sequence) ؛

دلیل بروز مشکل                                       راه حل             
*ناکافی بودن میزان پرایمر

*ناکافی بودن میزان DNA

*تغییر مقادیر پرایمر و یا DNA
*وجود آلودگی های مهارکننده در نمونه شامل فنول، اتانول و  EDTA *پاکسازی( Purification ) نمونه DNA از آلودگی ها

۳.ابتدای توالی خوانش شود، اما پس از آن پیک نداشته باشیم (Signal dropped soon after read start)

دلیل بروز مشکل راه حل
*تشکیل دایمر پرایمر یا وجود ساختارهای ثانویه در پرایمر

* میزان GC پرایمر یا توالی DNA بالا باشد

*عدم تناسب بین غلظت پرایمر مورد استفاده به DNA

* طراحی مجدد پرایمر که فاقد hairpin یا ساختارهای ثانویه باشد

*  تغییر ست آپ PCR برای توالی با GC بالا

* تصحیح نسبت غلظت پرایمر به DNA

۴-حذف پیک ها پس از یک خوانش کوتاه از یک ناحیه هموپلی مر(Signal dropped after homo polymer region ):

    :Poly C/T

    :Poly G/T

دلیل بروز مشکل راه حل          
*بدلیل هموپلی مر بودن توالی پدیده Replication slippage رخ داده است                                  تغییر ست آپ PCR از نظر شرایط cycle sequencing conditions وpurification و انجام مجدد PCR

*طراحی پرایمر اختصاصی برای نواحی هموپلی مر

5.پیک ها بصورت در هم فشرده باشند (Signal Top heavy) :

دلیل بروز مشکل راه حل
*غلظت بالای DNA یا پرایمر مورد استفاده

*وجود آلودگی های مهارکننده در نمونه شامل فنول، اتانول و  EDTA

* اندازه گیری غلظت DNA و پرایمر قبل از انجام  PCR

* یک مرحله اضافی شستو تا آلودگی DNA  با اتانول مرتفع شود

*  شست و شوی DNA در بافرهای Elution

(10mM Tris-Cl, pH 8.5) یا nuclease free H2O

6.خوانش پر از Noise  باشد (Noisy read)

A: Overall noisy sequence with weak raw signals

دلیل بروز مشکل راه حل
*کافی نبودن DNA الگو

* وجود مهارکننده های PCR

* نامناسب بودن دمای annealing پرایمرها

*عدم کفایت اتصال اولیه پرایمرها به DNA الگو

* اندازه گیری غلظت DNA و پرایمر قبل از انجام  PCR

* تغییر ست آپ چرخه PCR و ران مجدد نمونه ها

* رقیق کردن پرایمر

B: Overall noisy sequence with strong signal

دلیل بروز مشکل راه حل
* استفاده همزمان از  DNA های متفاوت بعنوان الگو

* آلوده بودن DNA

استفاده از پرایمرهای آلوده

*وجود چندین جایگاهاتصال غیراختصاصی برای پرایمر

*  تخلیص دوباره DNA

* اطمینان از استفاده یک پرایمرفوروارد یا ریورس نه هر دو در هنگام انجام توالی یابی

* بررسی وجود آلودگی در پرایمر یا DNA

* بررسی تاریخ انقضای پرایمر مورد استفاده

7.خوانش با تاخیر بوده و وجود پیک های نامتعارف قبل از خوانش صحیح توالی:

دلیل بروز مشکل راه حل
*وجود مشکل در کاپیلاری دستگاه Genetic Analyzer

*احتمال وجود آلودگی در DNA یا PCR-Product

*رفع مشکل کاپیلاری

*پاکسازیPurification نمونه  DNA از آلودگی ها

8.وجود پیک های ناخواسته بلند در خوانش (Large raw signal spike ):

دلیل بروز مشکل راه حل
*وجود مشکل در کاپیلاری دستگاه    Genetic Analyzer  *رفع مشکل کاپیلاری

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

بررسی تخصصی

توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

دیدگاه کاربران

1 دیدگاه برای توالی یابی سنگر | Sanger Sequencing

  1. gralion torile

    Hello there, You have done an incredible job. I’ll certainly digg it and personally recommend to my friends. I’m confident they’ll be benefited from this site.

دیدگاه خود را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *