cDNA چیست ؟ چه کاربرد‌هایی دارد ؟

 

 

در بیولوژی مولکولی، ساخت DNA مکمل (cDNA) از یک رشته الگوی RNA  بوده که توسط آنزیم ‌ترانس کریپتاز معکوس (RT) صورت می‌گیرد. ساخت cDNA، مرحله‌ی اول بسیاری از فعالیت‌های بیولوژی مولکولی می‌باشد. همچنین از cDNA درکلون کردن ژن و ساخت کتابخانه ژنی استفاده می‌شود. ازدیگر کاربردهای cDNA در بیولوژی مولکولی می‌توان به تجزیه و تحلیل پروفایل‌های رونویسی در بافت‌های تک سلولی یا تک هسته‌ای‌ها اشاره کرد که در سنجش‌هایی مانند ریزآرایه‌ها و RNA-seq استفاده می‌شود. معمولاً از cDNA برای کلون ژن‌های یوکاریوتی در پروکاریوت‌ها استفاده می‌شود. به منظور بیان پروتئین خاص در سلولی که به طور معمول بیان پروتئین مورد نظر در آن صورت نمی‌گیرد (بیان هترولوگ)؛ cDNA ای که پروتئین مورد نظر را کد می کند به سلول گیرنده منتقل می‌شود. . بیان یک ژن از یک بافت به بافت دیگر، از یک سلول به سلول دیگر یا حتی در شرایط زمانی متفاوت متغیر است. در نتیجه می‌توان برای مطالعه‌ی ظرفیت بیانی یک سلول mRNA‌های آن را مورد بررسی قرار داد. در زمینه بیوانفورماتیک از اصطلاح cDNA برای اشاره به توالی رونوشت mRNA استفاده می‌شود که نشان دهنده‌ی تفاوت در بازهای دئوکسیDNA  (deoxy-ATCG) در مقابل بازهای RNA (GCAU) می‌باشد.

 

جهت خرید کیت سنتز cDNA کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت سنتز cDNA کیاژن فناور کلیک کنید.

 

سنتز cDNA در طبیعت و به صورت مصنوعی چگونه صورت می‌گیرد ؟

 

به طور طبیعی cDNA توسط رتروویروس‌ها (مانند HIV-1، HIV-2، ویروس نقص ایمنی میمون و …) تولید می‌شود و سپس در ژنوم میزبان ادغام شده و در آنجا ایجاد یک پروویروس می‌کند.

cDNA از یک مولکول DNA تک رشته‌ای تشکیل شده است که از مولکول های mRNA در فرآیندی به نام رونویسی معکوس توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس سنتز می‌شود. DNA شامل هر دو ناحیه کد کننده و غیر کد کننده ژنوم است. اما، cDNA فقط شامل مناطق کد کننده یا اگزون‌ها است.

برای سنتز cDNA در مرحله‌ی اول RNA به عنوان الگو عمل می‌کند.

 

• آماده‌سازی نمونه

RNA کل، به طور معمول در سنتز cDNA برای کاربردهای پایین دستی مانند RT-(q)PCR استفاده می شود، در حالی که انواع خاصی از RNA ها (مانند RNA پیام رسان (mRNA  و RNA های کوچک مانند (miRNA)  ممکن است برای کاربردهای خاصی مانند ساخت کتابخانه cDNA و پروفایل miRNA غنی شوند.

حفظ یکپارچگی RNA حیاتی است و نیاز به دقت فراوان در طول استخراج، پردازش، ذخیره سازی و استفاده آزمایشی دارد. بهترین روش‌ برای جلوگیری از تخریب RNA استفاده از وسایل و دستکش‌های نوکلئاز فری و ضدعفونی کردن مناطق کار است.

در مرحله‌ی اول جهت سنتز cDNA نیاز به جداسازی و خالص‌سازی RNA می‌باشد. استراتژی‌های مختلفی بسته به نوع مواد منبع (مانند خون، بافت‌ها، سلول‌ها، گیاهان) و اهداف آزمایش‌ها در دسترس است. اهداف اصلی در جداسازی؛ پایدار‌سازی مولکول‌های RNA، مهار RNases، و به حداکثر رساندن بازده با روش‌های بهینه‌ی ذخیره‌سازی و استخراج مناسب می‌باشد. پس از خالص سازی، RNA باید در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد ذخیره شود.

 

جهت خرید کیت استخراج Total RNA Isolation kit | RNA کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت استخراج Total RNA Isolation kit | RNA کیاژن فناور کلیک کنید.

جهت خرید کیت استخراج RNA از سلول و بافت جانوری  Animal Tissue RNA isolation kit کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت استخراج RNA از سلول و بافت جانوری  Animal Tissue RNA isolation kit کیاژن فناور کلیک کنید.

جهت خرید کیت استخراج RNA از خون  Blood RNA isolation kit کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت استخراج RNA از خون  Blood RNA isolation kit کیاژن فناور کلیک کنید.

جهت خرید کیت استخراج RNA ویروسی ( Viral RNA Extraction kit (RENAViro کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت استخراج RNA ویروسی ( Viral RNA Extraction kit (RENAViro  کیاژن فناور کلیک کنید.

 

• حذف DNA ژنومی

مقادیر کمی از DNA ژنومی ( gDNA) ممکن است به همراه RNA خالص شود. gDNA آلوده می تواند با رونویسی معکوس تداخل داشته باشد و ممکن است منجر به نمایش نتیجه‌ی مثبت کاذب شود.

روش سنتی حذف gDNA، افزودن DNase I به RNA جدا شده است. DNase I باید قبل از سنتز cDNA حذف شود زیرا هر آنزیم باقیمانده DNA تک رشته ای را تجزیه می‌کند. متأسفانه، از دست دادن یا آسیب RNA می تواند در طی غیرفعال سازی DNase I رخ دهد.

 

جهت خرید آنزیم دی ان ایز DNase | آنزیمDNase RNase Free کیاژن فناور یا دریافت قیمت آنزیم دی ان ایز DNase | آنزیم DNase RNase Freeکیاژن فناور کلیک کنید.

 

• انتخاب ترانسکریپتاز معکوس

در این مرحله با توجه به طول رشته سنتزی مورد نظر آنزیم ترانسکریپتاز معکوس MMLV یا AMV انتخاب می‌گردد. در ادامه تفاوت‌ها و عملکرد این آنزیم‌ها بیشتر توضیح داده می‌شود.

 

• سنتز cDNA

واکنش‌های رونویسی معکوس شامل سه مرحله اصلی است: اتصال پرایمر، پلیمریزاسیون DNA و غیرفعال کردن آنزیم. دما و مدت این مراحل بر اساس انتخاب پرایمر، RNA هدف و ترانس کریپتاز معکوس مورد استفاده متفاوت است.

مهمترین مرحله پلیمریزاسیون DNA است. در این مرحله، دما و مدت زمان واکنش ممکن است با توجه به انتخاب پرایمر و ترانس کریپتاز معکوس مورد استفاده، متفاوت باشد.

 

در بین رونوشت‌های معکوس تفاوت‌هایی در پایداری حرارتی وجود دارد که برای هرکدام بالاترین دمای بهینه پلیمریزاسیون تعیین شده است. استفاده از ترانس کریپتاز معکوس مقاوم در برابر حرارت اجازه می‌دهد تا دمای واکنش بالاتر (مثلاً ۵۰ درجه سانتیگراد) به واسرشتگی RNA با محتوای GC بالا یا آن دسته از RNAها که دارای ساختارهای ثانویه هستند، بدون آنکه بر فعالیت آنزیم تأثیری داشته باشد، کمک کند. چنین آنزیم هایی که توانایی فعالیت در دماهای بالا دارند منجد به افزایش بازده واکنش و تولید cDNA با طول کامل می‌شوند.

مولکول RNA استخراج شده حاوی کلاهک ‘5 و دم پلی A در قسمت انتهایی ‘3 می‌باشند. این رشته تنها دارای اگزون می باشد. قبل از اضافه کردن ترانسکریپتاز معکوس باید پرایمر DNA را به انتهای ‘3 مولکول mRna اضافه کرد. از آنجا که تمام mRNA های یوکاریوتی دارای دم پلی A هستند، ساخت پرایمر برای رشته mRNA آسان است و تنها باید رشته ی حاوی پلی T ساخت. سپس در محلول واکنش mRNA را با پرایمر مخلوط می‌کنیم تا در دمای مناسب پرایمر با رشته الگو هیبرید ‌گردد.

در مرحله بعد ترانسکریپتاز معکوس اضافه شده که به پرایمر متصل می‌شود. محلول واکنش حاوی dNTPs می‌باشد که برای سنتز رشته cDNA مورد نیاز است. در این مرحله رشته‌ی در حال سنتز به رشته‌ی mRNA متصل است. سپس می‌خواهیم دو رشته را از یکدیگر جدا کنیم چرا که تنها به رشته سنتز شده‌ی cDNA نیاز می‌باشد. از آنجا که رشته‌ی RNA نسبت به DNA ناپایداری بیشتری دارد، می‌توان با افزایش PH و بازی کردن محلول رشته RNA را هیدرولیز کرد و رشته‌ی cDNA را سالم در اختیار خواهیم داشت.

 

جهت خرید آنزیمM-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور یا دریافت قیمت آنزیمM-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور آریا کلیک کنید.

 

تفاوت‌های cDNA و DNA و RNA چه مواردی هستند ؟

 

DNA و cDNA دو نوع اسید نوکلئیک هستند. DNA ماده ژنتیکی اکثر موجودات است. در داخل هسته در یوکاریوت‌ها مرتب شده است. در پروکاریوت‌ها، DNA در سیتوپلاسم وجود دارد. در طول رونویسی، RNA پیام رسان از توالی‌های DNA تولید می شود. این mRNA توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس به DNA مکمل یا cDNA رونویسی می شود. تفاوت اصلی بین DNA و cDNA در این است که DNA از هر دو توالی کد کننده و غیر کد کننده تشکیل شده است در حالی که cDNA فقط شامل توالی های کد کننده است. توالی های کد کننده اگزون های یک ژن هستند که یک پروتئین عملکردی را کد می کند. توالی های غیر کد کننده، توالی های DNA باقی مانده از ژنوم هستند. برخی از توالی های غیر کد کننده شامل عناصر تنظیمی هستند که در تنظیم بیان ژن نقش دارند.

 

 

 

• شباهت بین DNA و cDNA

DNA و cDNA از نوکلئوتیدهای DNA تشکیل شده‌اند.

هر دو DNA و cDNA از چهار باز نیتروژنی A، G، C و T تشکیل شده‌اند.

هر دو DNA و cDNA از قند دئوکسی ریبوز تشکیل شده‌اند.

DNA و cDNA هر دو حاوی یک ستون فقرات قند فسفات هستند.

هر دو DNA و cDNA از مناطق کد کننده تشکیل شده‌اند.

 

• تفاوت بین DNA و cDNA

: DNA به نوعی از اسید نوکلئیک اطلاق می‌شود که از یک مارپیچ دوگانه تشکیل شده است که توسط پیوندهای هیدروژنی بین پورین‌ها و پیریمیدین‌ها در دو زنجیره نگه داشته می‌شود. از ژنوم‌های موجود سنتز می شود. از DNA می توان برای تولید کتابخانه‌های ژنومی استفاده کرد.

: cDNA به DNA تک رشته ای اطلاق می شود که با استفاده از mRNA سیتوزولی به عنوان الگو سنتز می‌شود. کل cDNA یک موجود زنده را ترانسکریپتوم می‌نامند. از cDNA می توان برای تولید کتابخانه‌های cDNA استفاده کرد.

 

cDNA با کدام رشته DNA و RNA مشابهت دارد ؟

 

DNA  از یکسری ژن گسسته در سلول، اینترون (نواحی غیر کد کننده) و اگزون (نواحی کد کننده) تشکیل شده است. در هنگام رونویسی و ویرایش، ژن تبدیل به mRNA بالغ شده و تنها دارای اگزون می‌باشد. حال این mRNA بالغ به cDNA تبدیل می‌شود که تفاوت آن با DNA حذف اینترون‌ها می‌باشد. DNA و cDNA دو شکل از اسیدهای نوکلئیک هستند که به طور گسترده در تکنیک‌های بیولوژی مولکولی استفاده می شوند.

 

جهت سنتز و ساخت cDNA چه موادی مورد نیاز هستند ؟

 

آنچه در سنتز cDNA حائز اهمیت است، نوع پرایمرها و نوع RTase مورد استفاده است. بسته به الگوی RNA و کاربرد پایین دست، سه نوع پرایمر برای شروع رونویسی معکوس استفاده می شود: پرایمرهای oligo(dT)، پرایمرهای تصادفی و پرایمرهای اختصاصی ژن. برای جلوگیری از فراوانی رونوشت های cDNA کوتاه شده، طراحی پرایمر دقیق مورد نیاز است. امروزه طیف وسیعی از محصولات انعطاف ‌پذیر و راحت برای سنتز cDNA ارائه شده است از جمله کیت‌های حاوی هگزامرهای تصادفی پیش‌آمیخته و الیگو (dt) لنگردار که برای تولید cDNA برای استفاده در آزمایش‌های PCR real-time بهینه شده‌اند.

 

 

علاوه بر آنزیم و پرایمرها، اجزای اصلی واکنش برای رونویسی معکوس شامل الگوی RNA، بافر، dNTPs، DTT، مهارکننده‌های RNase ( جهت غیرفعال کردن آنزیم‌های ریبونوکلئاز ) و آب بدون RNase است.

جهت خرید آنزیم M-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور یا دریافت قیمت آنزیمM-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور آریا کلیک کنید.

جهت خرید کیت سنتز cDNA کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت سنتز cDNA کیاژن فناور کلیک کنید

جهت خرید کیت One Step Real time PCR Master Mixکیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت One Step Real time PCR Master Mixکیاژن فناور کلیک کنید

 

 

از DTT به عنوان یک عامل محافظتی استفاده می شود که از اکسیداسیون گروه های تیول جلوگیری می کند. DTT اغلب برای کاهش پیوندهای دی سولفیدی پروتئین ها و به طور کلی برای جلوگیری از تشکیل پیوندهای دی سولفیدی درون مولکولی و بین مولکولی بین باقی مانده های سیستئین پروتئین‌ها استفاده می شود.

 

چه تفاوتی بین آنزیم‌های پلیمراز و ترانس کریپتاز و نحوه واکنش های این آنزیم‌ها وجود دارد؟

 

آنزیم‌های DNA پلیمراز مختلفی در سلول‌های یوکاریوتی و پروکاریوتی وجود دارند. این آنزیم‌ها نقش اصلی در همانندسازی دارند. انواع متفاوتی از این آنزیم در سلول‌های یوکاریوتی و پروکاریوتی وجود دارند که انواع یوکاریوتی آن با حروف رومی و انواع پروکاریوتی با اعداد رومی نامگذاری شده‌اند.

عملکرد	زیر واحدها	آنزیم‌های DNA پلیمراز پروکاریوتی
حذف پرایمر RNA، اصلاح DNA	۱	Pol I
ترمیم DNA	۱	Pol II
همانندسازی کروموزوم	۳	Pol III core
همانندسازی کروموزوم	۹	Pol III holoenzyme
ترمیم DNA	۱	Pol IV
ترمیم DNA	۳	Pol V

 

 

 

عملکرد	زیر واحدها	آنزیم‌های DNA پلیمراز پروکاریوتی
ساخت پرایمر در زمان همانندسازی	۴	Pol α
ترمیم DNA	۱	Pol β
همانندسازی ژنوم میتوکندریایی و کلروپلاستی	۳	Pol γ
همانندسازی DNA، ترمیم DNA	۲-۳	Pol δ
همانندسازی DNA، ترمیم DNA	۴	Pol ε

 

ترانس کریپتازهای معکوس،  DNA پلیمرازهای وابسته به RNA هستند که برای اولین بار به عنوان بخشی از چرخه زندگی رتروویروسی شناخته شدند. RT ها سنتز cDNA را به این صورت انجام می‌دهند که مولکول های RNA هدف را با استفاده از پرایمر رونویسی معکوس (رشته پلی T)،  dNTPs و  یا   به عنوان کوفاکتور کاتالیز می کنند.

ویروسهایی مانند HIV و هپاتیت B برای تکثیر ژنوم خود از ترانس کریپتازهای معکوس استفاده می‌کنند. همچنین ترانسپوزون‌ها (عناصر ژنتیکی متحرک (برای تکثیر در ژنوم میزبان و سلول‌های یوکاریوتی برای گسترش تلومرها در انتهای کروموزوم‌های خطی از این آنزیم بهره می‌گیرند.

فعالیت بیوشیمیایی ترانس کریپتاز معکوس رتروویروسی شامل: فعالیت DNA پلیمرازی وابسته به RNA، دومین عملکردی ریبونوکلئازH (RNase H) و فعالیت DNA پلیمراز وابسته به DNA است. در مجموع، این فعالیت‌ها آنزیم را توانمند ساخته تا از تک رشته RNA یک cDNA دو رشته‌ای بسازد. در رتروویروس‌ها و رتروترانسپوزون‌ها، این cDNA می‌تواند در ژنوم میزبان ادغام شود، که از آن می‌توان نسخه‌های RNA جدیدی از طریق رونویسی سلول میزبان ایجاد کرد.

 

ترانس کریپتاز‌های معکوس که به خوبی مطالعه شده اند عبارتند از:

ترانس کریپتاز معکوس HIV-1 از ویروس نقص ایمنی انسانی نوع ۱ دارای دو زیر واحد است که وزن مولکولی آن‌ها ۶۶ و ۵۱ کیلو دالتون است.

ترانس کریپتاز معکوس M-MLV از ویروس لوسمی موش مولونی یک مونومر ۷۵ کیلو دالتون است.

ترانس کریپتاز معکوس AMV از ویروس میلوبلاستوز پرندگان که دارای یک زیر واحد ۶۳ کیلو دالتون و یک زیر واحد ۹۵ کیلو دالتونی می‌باشد.

ترانس کریپتاز معکوس تلومراز که تلومرهای کروموزوم‌های یوکاریوتی را حفظ می کند.

 

همه RT ها سنتز cDNA را کاتالیز می کنند، اما برخی از آنزیم‌ها برای اهداف RNA خاص و کاربردهای پایین دستی نسبت به سایرین ترجیح داده می‌شوند. انتخاب بهترین RT برای آزمایش شما زمانی که خواص آنزیمی اساسی و ملاحظات مهمی مانند طول RNA هدف، وجود ساختار ثانویه پیچیده RNA، کاربرد پایین دستی و سطح فعالیت RNase H آنزیم را درک کنید، دشوار نیست. در اینجا به بسیاری از این ملاحظات مهم برای انتخاب ترانس کریپتازهای معکوس مناسب اشاره می‌کنیم.

 

جهت خرید آنزیمM-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور یا دریافت قیمت آنزیمM-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور آریا کلیک کنید.

جهت خرید کیت سنتز cDNA کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت سنتز cDNA کیاژن فناور کلیک کنید.

برای بررسی کیت ها و آنزیم های پلیمراز کیاژن فناور بر روی لینک زیر کلیک کنید.

 

آنزیم‌های مورد استفاده در سنتز cDNA کدامند و چه تفاوت‌هایی دارند ؟

• ترانس کریپتاز معکوس ویروس میلوبلاستوز پرندگان

ترانس کریپتاز معکوس ویروس میلوبلاستوز پرندگان(AMV)  یکی از رایج ترین RT های مورد استفاده در آزمایشگاه است. هترودایمر ۱۷۰ کیلو دالتونی برای فعالیت به ۱۰-۶ میلی‌مولار  یا   نیاز دارد و واکنش‌ها اغلب شامل سدیم پیروفسفات و اسپرمیدین برای افزایش تولید cDNA با تمام طول و کاهش تشکیل ساختار سنجاق سری در طول سنتز می‌باشد. ساختار ثانویه mRNA برای بسیاری از فرآیندها ضروری است، اما می تواند یک مشکل فنی در ساخت cDNA با ترانسکریپتازهای معکوس ایجاد کند. AMV RT در مقایسه با ویروس لوسمی موش مولونی (M-MLV) RT حساسیت کمتری نسبت به مهار شدن با ساختار ثانویه RNA دارد.

فعالیت بهینه آنزیم و سنتز حداکثر طول cDNA در ۴۸-۴۲ درجه سانتیگراد رخ می‌دهد، اما دمای واکنش می تواند از ۲۵ درجه سانتیگراد تا ۵۸ درجه سانتیگراد متغیر باشد. دمای بالای  واکنش به دناتوره کردن مناطقی که دارای ساختار ثانویه RNA هستند کمک می‌کند، اما این افزایش دما می‌تواند باعث توقف RT ها و محدود کردن اندازه cDNA شود. به همین دلیل، AMV RT اغلب برای رونویسی معکوس RNA هایی با ساختار ثانویه استفاده می‌شود. مانند سایر RT ها، AMV RT با پرایمرهای اختصاصی ژن، پرایمرهای oligo یا هگزامرهای تصادفی سازگار است. اگرچه استفاده از هگزامرهای تصادفی نیاز به کاهش دمای واکنش تا ۳۷ درجه سانتی گراد را دارند. پرایمرهای RT اختصاصی ژن با دمای ذوب مناسب زمانی توصیه می شود که دمای واکنش از ۴۲ درجه سانتی گراد بیشتر شود.

 

اگرچه دمای واکنش بالا می تواند باعث واسرشتگی ساختارهای ثانویه شود، اما این دماها برای یکپارچگی RNA مضر هستند. از آنجا که RNA ناپایدار می باشد، به حرارت و کاتالیزورهای فلزی حساس است و به سرعت تجزیه می‌شود. هیدرولیز RNA تحت شرایط خاصی (به عنوان مثال، pH غیربهینه، دماهای بالا، وجود کاتیون‌های دو ظرفیتی) یک چالش جدی می‌باشد. بنابراین، بهتر است برای سنتز cDNA به ویژه سنتز cDNA  از الگویی با RNA طویل، از قرار ندادن RNA در دمای واکنش بالاتر جلوگیری شود. برای به حداقل رساندن مدت زمانی که RNA در دماهای بالا می‌گذراند، پروتکل‌های سنتز cDNA با استفاده از RT های AMV و M-MLV اغلب یک مرحله دناتوره سازی اولیه را شامل می‌شوند، جایی که پرایمر RNA و RT با هم ترکیب می‌شوند و برای کمک به دناتوره کردن هر ساختار ثانویه میزان کمی حرارت اعمال شده و سپس به سرعت روی یخ سرد می‌شوند تا حالت دناتوره آن‌ها حفظ گردد. RT، بافر واکنش و dNTP ها اضافه می‌شوند و واکنش در دمای مورد نظر انکوبه می‌شود.

 

AMV RT دارای یک فعالیت RNase H ذاتی است که رشته RNA در هیبرید RNA/DNA را تخریب می‌کند و اگر RT در طول سنتز مکث کند می تواند الگوی RNA را بشکند. این ویژگی بازده کل cDNA و درصد cDNA با تمام طول را کاهش می‌دهد و سودمندی AMV RT را برای رونوشت برداری معکوس RNA‌های طولانی‌تر از Kb‌۵ ̴   را محدود می‌کند.

 

شرایط معمول RT-PCR شامل استفاده از حداکثر ۵ میکروگرم RNA کل یا حداکثر 100 نانوگرم mRNA دارای دم پلیA، ۲۰ تا ۳۰ واحد آنزیم و انکوباسیون ۶۰ دقیقه‌ای در دمای ۴۲ درجه سانتی‌گراد می‌باشد. AMV RT بسیار محکم‌تر به الگو-پرایمر متصل می‌شود و تمایل بسیار بیشتری به باقی ماندن در طول سنتز cDNA نسبت به M-MLV RT دارد و بنابراین در هنگام غیرفعال شدن با حرارت بهترمحافظت می‌شود. قبل از PCR، AMV باید غیرفعال شود زیرا AMV RT، مانند M-MLV RT، می تواند Taq DNA پلیمراز را مهار کند. آنزیم را می‌توان با حرارت دادن در دمای ۷۰ تا ۱۰۰ درجه سانتیگراد و سپس انکوباسیون ۵ دقیقه ای روی یخ غیرفعال کرد. استفاده از AMV RT برای RT-PCR یک مرحله ای و دو مرحله ای، RT-qPCR، رونویسی معکوس RNA های کمتر ازKb‌ ۵ توصیه می شود، به خصوص اگر RNA الگو دارای ساختار ثانویه قوی باشد.

 

• ترانس کریپتاز معکوس ویروس لوسمی موشی مولونی

از آنزیم ویروس لوسمی موش مولونی RT اغلب برای رونویسی معکوس RNA های طولانی (>Kb‌ ۵) به دلیل فعالیت کمتر RNase H در مقایسه با AMV RT استفاده می‌شود. با این حال، دمای کمتر واکنش ۳۷ درجه سانتی گراد می تواند رونویسی معکوس RNA ها با ساختار ثانویه قوی را مشکل ساز کند. انواع وحشی M-MLV RT به دلیل فقدان فعالیت RNase H و انجام واکنش با دمای بالا، محبوب هستند. نوعی از آنزیم که بیشتر مورد استفاده است دارای جهش نقطه‌ای بوده که  یک اسید آمینه جایگزین شده است و به طور چشمگیری فعالیت RNase H را کاهش داده، و در عین حال فعالیت کامل DNA پلیمراز را حفظ کرده است. این جهش نقطه‌ای آنزیم را در برابر حرارت بسیار پایدارترکرده است. در حالی که برای نوع وحشی M-MLV RT دمای واکنش بهینه ۳۷ درجه سانتیگراد می‌باشد، از آنزیم جهش یافته می‌توان در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد استفاده کرد که به موجب این جهش می‌توان از آنزیم برای الگوهای RNA با ساختار ثانویه‌ی قوی استفاده کرد. با این حال، در غیاب ساختار ثانویه قوی، دمای کمتر واکنش منجر به تولید محصولات cDNA طولانی‌تر می‌شود.

فقدان فعالیت RNase H باعث می‌شود که M-MLV RT  جهش ‌یافته، آنزیم انتخابی برای رونویسی معکوس RNA‌های طولانی جهت ساخت کتابخانه cDNA، تولید پروب cDNA و گسترش پرایمر‌باشد.

 

جهت خرید آنزیمM-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور یا دریافت قیمت آنزیمM-MLV Reverse Transcriptase  آنزیم ریورس ترانسکریپتاز کیاژن فناور آریا کلیک کنید.

 

کیت سنتز cDNA چه کاربردی دارد ؟

 

کیت های سنتز cDNA وسیله ای سریع و قابل اعتماد برای تولید cDNA از نمونه‌های RNA را فراهم می‌کنند. این کیت‌های آماده برای استفاده راحت همراه با اجزای لازم برای رونویسی معکوس، از جمله ترانس کریپتاز معکوس (RT)، dNTPs، بافر واکنش، آب بدون نوکلئاز و مهارکننده‌های RNase هستند. در مواردی که غلظت RNA الگو کم بوده و یا ژن هدف جهت سنتز cDNA پیجیدگی خاصی داشتهاست، پروتکل‌های مناسب ارائه شده و معرف‌های با کیفیت بالا جهت سنتز cDNA با بازده حداکثری ارائه شده است. برای آغاز واکنش از پرایمرهای الیگو(dt)  یا هگزامرهای تصادفی (یا هر دو) می‌توان استفاده کرد. هنگام انتخاب یک کیت سنتز cDNA، اندازه قطعه رونویسی شده، سازگار بودن با برنامه‌های پایین دستی و تعداد واکنش ها در هر کیت را باید در نظر گرفت. در صورت استفاده از هگزامرهای تصادفی، توصیه می‌شود واکنش رونویسی معکوس را در دمای اتاق (~25 درجه سانتیگراد) به مدت 10 دقیقه پس از افزودن آنزیم برای گسترش پرایمرها انکوبه کنید.

 

جهت خرید کیت سنتز cDNA کیاژن فناور یا دریافت قیمت کیت سنتز cDNA کیاژن فناور کلیک کنید.

 

چرا در کیت‌های سنتز cDNA از ژن‌های Housekeeping استفاده می‌کنیم ؟

 

ژن‌های خانه‌داری به‌عنوان ژن‌های نگهدارنده سلولی شناخته می‌شوند که عملکردهای اساسی  سلول در تمامی قسمت‌ها را تنظیم می‌کنند، و بنابراین کاندیدای معتبری برای عمل به عنوان کنترل‌های داخلی برای بیان ژن هستند. RT-qPCR عمدتاً به دلیل توانایی و کارآمدی آن در تولید مقادیر کمی از RNA در مدت زمان نسبتاً کوتاه محبوب است. از این ژن ها به عنوان کنترل در واکنش استفاده میشود و همچنین میزان  بیان دیگر ژن ها به نسبت بیان این ژن ها مشخص می شود.

 

Oligo dt , random hexamer چه هستند و چه کاربردهایی در سنتر cDNA  دارند؟

 

تفاوت اصلی بین پرایمرهای تصادفی و الیگو dT در این است که پرایمر تصادفی مخلوطی از تمام توالی‌های الیگونوکلئوتیدی هگزامر ممکن است، در حالی که پرایمر الیگو dT از یک تک رشته ای ۱۸-۱۲دئوکسی تیمیدین تشکیل شده است.

پرایمرهای تصادفی و پرایمرهای اولیگو dT دو نوع پرایمر رایج هستند که در رونویسی معکوس استفاده می شوند. بنابراین، پرایمر تصادفی یا پرایمر اولیگو dT توالی‌های الیگونوکلئوتیدی DNA کوتاهی هستند که برای رونویسی معکوس برای شروع رونویسی معکوس اکثر گونه‌های RNA، از جمله RNA تخریب شده، RNA که فاقد دم پلی (A) و RNA حاوی ساختارهای ثانویه می‌باشند، مفید هستند. بسته به قالب RNA، پرایمر مناسب را می توان از بین این دو نوع پرایمر انتخاب کرد.

پرایمر تصادفی مخلوطی از الیگونوکلئوتیدها است که تمام توالی‌های هگزامری ممکن را نشان می‌دهد. توالی پرایمر، پرایمر تصادفی 5’-d (NNNNNN)-3’ که نوکلئوتیدهای N میتواند هر یک از بازهای A,T,C و یا G باشد. بنابراین، پرایمرهای تصادفی را می‌توان برای تکثیر DNA یا RNA تک رشته ای توسط DNA پلیمراز یا ترانسکریپتاز معکوس استفاده کرد. علاوه بر این، مخلوط پرایمر تصادفی قادر است تمام نواحی RNA را برای تولید cDNA تقویت کند. بنابراین، طول‌های مختلف cDNA را تولید می‌کند.

مهمتر از همه، مخلوط پرایمر تصادفی ویژگی الگو را نشان نمی دهد. از این رو قادر به تشخیص mRNA و سایر گونه های RNA نیست و به هرگونه RNA موجود در نمونه متصل می‌شود. با این حال، مخلوط پرایمر تصادفی برای رونویسی معکوس RNA های بدون دم پلیA  مانند rRNA، tRNA، RNA های غیر کد کننده، RNA های کوچک، mRNA های پروکاریوتی، RNA تخریب شده و RNA با ساختارهای ثانویه شناخته شده مناسب است.

پرایمر الیگو dT رشته‌ای از 12 تا 18 دئوکسی تیمین (dt) است. دنباله پرایمر را می توان به صورت 5’ – d(TTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3’ نشان داد. برای تولید cDNA از mRNA حاوی دم پلی A استفاده می‌شود. اساساً به عنوان یک پرایمر برای واکنش کاتالیز شده توسط ترانس کریپتاز معکوس عمل می‌کند. در طول رونویسی معکوس، پرایمر الیگو dT با دم پلی آدنیله موجود در انتهای 3′ اکثر mRNA های یوکاریوتی متصل شده و فرآیند را آغاز می کند.

بر خلاف پرایمر تصادفی، پرایمر الیگو dT برای RNA یا RNA تخریب شده که فاقد دم پلی (A)  هستند، از جمله RNA و microRNA پروکاریوتی مناسب نیست.

 

آنزیم DNase  چیست و انواع آن کدامند ؟

 

آنزیم‌های دئوکسی ریبونوکلئاز (DNase) نقش‌های مهم سلولی مختلفی را با تجزیه DNA از طریق هیدرولیز ستون فقرات فسفودی استر آن انجام می‌دهند. آنزیم‌های دئوکسی ریبونوکلئاز Ӏ (DNase I) به صورت غیر اختصاصی هر دو نوع مولکول DNA  تک رشته یا دو رشته‌ای را می‌شکافند. این آنزیم‌ها برای عملکرد خود به یون‌های فلزی دو ظرفیتی برای هیدرولیز DNA نیاز دارند و محصولات 3′-هیدروکسیل و 5′-فسفریله شده را تولید می‌کنند. در مقابل، دئوکسی ریبونوکلئازӀӀ (DNase II) مولکول DNA  را در pH پایین هیدرولیز می‌کند تا محصولات 3′-فسفریله و 5′-هیدروکسیل تولید کند. به طور قابل توجهی، بر خلاف بسیاری از آنزیم های دیگر مثل نوکلئازها و تمام پلیمرازهای اسید نوکلئیک، DNase II برای کاتالیز به یون های فلزی دو ظرفیتی نیاز ندارد.

جهت خرید آنزیم دی ان ایز DNase | آنزیمDNase RNase Free کیاژن فناور یا دریافت قیمت آنزیم دی ان ایز DNase | آنزیم DNase RNase Freeکیاژن فناور کلیک کنید.

 

چرا از آنزیم Dnase  در سنتز cDNA استفاده می‌کنیم ؟

 

در هنگام آماده سازی نمونه برای سنتز cDNA مقادیر کمی از DNA ژنومی (gDNA)  ممکن است با RNA خالص شود. gDNA آلوده می تواند با رونویسی معکوس تداخل داشته باشد و ممکن است منجر به نتیجه مثبت کاذب، پس زمینه بالاتر یا تشخیص کمتر در برنامه‌های حساس مانند RT-qPCR شود.

روش سنتی حذف gDNA، افزودن DNase I به آماده سازی RNA جدا شده است. DNase I باید قبل از سنتز cDNA حذف شود زیرا هر آنزیم باقیمانده، DNA تک رشته ای را تجزیه می کند. متأسفانه، از دست دادن یا آسیب RNA می تواند در طول تیمار برای غیرفعال سازی DNase I رخ دهد.

به عنوان جایگزینی برای DNase I، DNase های دو رشته ای خاص برای از بین بردن gDNA آلوده بدون تأثیر بر RNA یا DNA های تک رشته ای در دسترس هستند. خاصیت حرارت پذیری آنها غیرفعال سازی ساده را در دمای نسبتاً ملایم (مثلاً ۵۵ درجه سانتیگراد) بدون تأثیرات منفی امکان پذیر می کند. چنین DNase های دو رشته ای خاص و حرارت پذیر را می توان با RNA به مدت ۲ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قبل از واکنش‌های رونویسی معکوس انکوبه کرد تا جریان کار ساده شود.

 

جهت خرید آنزیم دی ان ایز DNase | آنزیمDNase RNase Free کیاژن فناور یا دریافت قیمت آنزیم دی ان ایز DNase | آنزیم DNase RNase Freeکیاژن فناور کلیک کنید.

 

حداقل میزان RNA برای سنتز cDNA چه مقداراست و مقدار و کیفیت cDNA به دست آمده به چه چیزهایی بستگی دارد ؟

 

برای سنتز cDNA از الگوی RNA در واکنش حداکثر 2.5 میکروگرم در 20 میکرولیتر واکنش مورد نیاز است. مقدار زیاد RNA الگو ممکن است بر عملکرد RT-PCR تأثیر بگذارد. به همین علت باید مقدار الگوی RNA را کاهش داد. راه حل مناسب به هنگام انجام RT-PCR برای سنتز cDNA صرفه جویی در زمان می‌باشد که برای این منظور تمام معرف های مورد نیاز برای سنتز cDNA، از جمله پرایمرهای هگزامر تصادفی، نوکلئوتیدها، بافرها و آنزیم‌ها تنها در دو ویال عرضه می‌شوند که نیاز به پیپتاژ را به حداقل می‌رساند. آنزیم منحصربفرد موجود در کیت دارای محدوده دمایی وسیعی است و برای رونویسی معکوس در دمای بالا مناسب است. مقدار پرایمرهای هگزامر تصادفی موجود در بافر واکنش رونویسی، بازده cDNA بالایی را از تمام مناطق الگوی RNA امکان پذیر می سازد

مقدار و کیفیت cDNA به دست آمده به کیفیت و کمیت RNA ورودی، محتوای mRNA نمونه و روش مورد استفاده برای خالص سازی RNA بستگی دارد. بازده cDNA معمولاً بین ۵-۱۵ نانوگرم (برای میزان کم RNA الگو) است. مقدار RNA در نمونه باید برای تعداد تقریبی چرخه های PCR به نسبت مناسبی استفاده شود. انتخاب آنزیم مناسب با طول رشته الگو از اهمیت بالایی برخوردار است. باید توجه شود که به هنگام آماده سازی واکنش تمامی آنزیم‌ها و بافرها بر روی یخ نگهداری شوند.

با استفاده از آنزیم بسیار فعال ‌ترانس کریپتاز معکوس مهندسی شده مولونی مورین لوکمیا ویروسی شاهد کاهش فعالیت RNase H  وافزایش پایداری حرارتی آن در مقایسه با نوع وحشی MMLV  می‌باشیم. در این صورت اختصاصیت بیشتر، بازده بالاتر و محصول cDNA بیشتری با طول کامل را در اختیار داریم. این قابلیت که انجام واکنش در دما‌های بالا انجام می‌پذیرد، هنگام برخورد با رشته الگو RNA که حاوی مقدار زیادی ساختار ثانویه است می‌تواند بسیار مفید می‌باشد.