تخلیه RNA ریبوزومی|ribosomal RNA depletion

تخلیه RNA ریبوزومی|ribosomal RNA depletion چیست؟

تخلیه ریبوزومی یک روش حیاتی در ترانس کریپتومیکس است که امکان تشخیص کارآمد کدگذاری مرتبط با عملکرد و همچنین رونوشت های غیر کدکننده را از طریق حذف گونه های rRNA بسیار فراوان فراهم می کند. غنی‌سازی RNA ترانسکریپتوم کامل با کاهش RNA ریبوزومی، یک مرحله حیاتی در آماده‌سازی نمونه‌ها برای استفاده در ریزآرایه‌های بیان ژن، RNA-Seq و سایر روش‌های آنالیز است. تنظیم بیان و انواع و عملکردهای RNA بسیار پیچیده تر از آن چیزی است که قبلاً تصور می شد، و ابزارهایی برای مطالعه RNA برای همگام شدن با علاقه ایجاد شده است.

تخلیه RNA ریبوزومی|ribosomal RNA depletion در مقابل انتخاب poly-A

غنی‌سازی mRNA با گرفتن انتهای 3′ پلی‌آدنیله شده رونوشت‌ها در بسیاری از فرآیندهای آماده‌سازی توالی‌یابی RNA امری عادی است. این روش برای poly-A RNA سریع و اختصاصی است. با این حال، اگر RNA به حدی تجزیه شده است که بیشتر mRNA از دم 3′ جدا می‌شود، یا نیاز به جداسازی رونوشت‌های غیر پلی‌آدنیله مانند RNA‌های طولانی غیرکدکننده دارید، تخلیه rRNA ممکن است گزینه بهتری باشد. روش‌های تخلیه RNA ریبوزومی به طور مستقیم rRNA را بر اساس توالی‌های RNA ریبوزومی متصل و حذف می‌کنند و رونوشت‌های دیگر را بدون در نظر گرفتن طول یا محتوای poly-A در نمونه باقی می‌گذارند. تخلیه RNA ریبوزومی از طریق حذف گونه‌های rRNA بسیار فراوان، تشخیص کارآمد کدگذاری مرتبط با عملکرد و همچنین رونوشت‌های غیر کدکننده را ارتقا می‌دهد. انتخاب Poly-A همچنین متکی به آن است که رونوشت‌ها تا حد زیادی دست نخورده باشند و تمایل دارند که مناطق 3′ رونوشت‌ها را بیش از حد نشان دهند. مطالعات مقایسه روش‌های تخلیه فیزیکی rRNA و انتخاب polyA نشان می‌دهد که انتخاب polyA برای نمونه‌های RNA تخریب ‌شده به خوبی کار نمی‌کند. تعداد کمتری از خوانش‌ها نیز با بافت‌های تعبیه‌ شده در پارافین (FFPE)  ثابت شده با فرمالین به‌دست می‌آید، اگرچه تجزیه و تحلیل بافت‌های منجمد تازه راضی کننده نبود. با وجود این، انتخاب polyA همچنان پوشش خارجی بیشتری نسبت به کاهش فیزیکی rRNA ارائه می‌کند که تمایل دارد خوانش‌های اینترونیک بیشتری تولید کند. علاوه بر این، معمولاً برای انتخاب polyA به عمق توالی کمتری نیاز است، که اگر تنها بر روی ژن‌های کدکننده پروتئین متمرکز شود، انتخاب قابل احترامی است.

چرا کاهش  RNA ریبوزومی|ribosomal RNA depletion برای RNA-seq انجام می شود؟

کاهش RNA ریبوزومی فراوانی نسبی RNA فاقد دنباله پلی آدنیله، RNA از پیش پردازش شده، tRNA های کوچک، siRNA، snRNA، microRNA، mRNA تکه تکه شده و سایر RNA های تنظیمی را افزایش می دهد که نمی توانند از طریق روش های انتخاب polyA+  خالص شوند.

چگونه تخلیه RNA ریبوزومی|ribosomal RNA depletion مبتنی بر پروب می تواند نتایج RNA-seq را بهبود بخشد؟

در سلول‌های یوکاریوتی، حدود 10 برابر مولکول‌های RNA ریبوزومی بیشتر از سایر انواع RNA موجود است. برای رونویسی، این RNA غیر ریبوزومی است که باید توالی یابی شود. اگر RNA کل توالی یابی شود، حدود 90٪ از RNA-seq خوانده شده ریبوزومی خواهد بود، و تنها 10٪ از خوانش‌ها مربوط به آزمایش شما باقی می ماند. اگر rRNA 97% تخلیه شود، کسری از قرائت های مربوطه به تقریبا 80% افزایش می یابد. با دستیابی به 99 درصد کاهش rRNA، برای RNA-seq حدود 90 درصد از خوانش‌ها مربوط به رونوشت خواهد بود.

تصویری از NGS نظری که در آن 0٪، 97٪ یا 99٪ از rRNA از نمونه RNA کل تخلیه می شود.

فناوری کاوشگر تخلیه RNA ریبوزومی برای RNA-seq یا ریزآرایه ها

فناوری تخلیه rRNA RiboMinus برای غنی‌سازی کل طیف رونوشت‌های RNA با تخلیه انتخابی مولکول‌های RNA ریبوزومی rRNA بدون توجه به وضعیت پلی‌آدنیلاسیون یا وجود ساختار 5′-cap طراحی شده است. نشان داده شده است که روش تخلیه rRNA RiboMinus اکثریت قریب به اتفاق ترین مولکول های RNA ریبوزومی (تا 99.9٪) را حذف می کند تا امکان بازجویی بیشتر رونوشت های کم فراوان را فراهم کند و داده های مفیدتری را از تجزیه و تحلیل های RNA-seq یا ریزآرایه به شما بدهد.

کاهش rRNA چگونه کار می کند؟

الیگونوکلئوتیدهای پروب بیوتینیله که برای اتصال RNA ریبوزومی طراحی شده اند به نمونه ای از RNA کل اضافه می‌شوند و اجازه می‌دهند هیبرید شوند. سپس دانه های پارامغناطیس پوشیده شده با استرپتاویدین به نمونه اضافه می‌شود و کمپلکس های بیوتین-الیگو-rRNA را می گیرد. سپس یک آهنربا اعمال می‌شود و به راحتی rRNA گرفته شده با مهره را از نمونه RNA کل حذف می‌کند. نمونه تهی شده از RNA ریبوزومی ممکن است بسته به کاربرد پایین دست متمرکز شود. کیت‌های تخلیه ریبومینوس rRNA، پروب‌های خاص گونه، دانه‌های مغناطیسی پوشیده شده با استرپتاویدین Dynabeads و ستون‌های اسپین متمرکز (اختیاری) را برای ساده‌سازی جریان کار تخلیه RNA ریبوزومی ارائه می‌کنند.

توسعه هدفمند

یک روش جایگزین برای تخلیه rRNA شامل استفاده از آغازگرهای هگزامر/هپتامر «نه چندان تصادفی» با کاهش میل ترکیبی برای rRNA در طول سنتز اولین رشته cDNA است. این توسط کیت های Ovation RNA-Seq از NuGen استفاده می شود. اگرچه این کیت می‌تواند برای شناسایی RNA‌های غیرپلیA استفاده شود و می‌توان آن را روی پروکاریوت‌ها اعمال کرد، ترکیب اضافی الیگوdT نسبت به شناسایی مناطق 3’ کمک می‌کند.

یک مطالعه پروفایل‌سازی ریبوزوم که روش‌های آماده‌سازی کتابخانه را با هم مقایسه می‌کند، در مقایسه با روش‌های انتخاب polyA، تعداد خواندن‌های کمتر و خواندن اینترونی بیشتری را برای کیت‌های Nugen گزارش کرد. از آنجایی که Nugen همچنین تخریب رونوشت های ناخواسته با واسطه RNase را در مراحل نهایی ساخت کتابخانه گنجانده است، این نشان می دهد که توسعه هدفمند به تنهایی نمی تواند به طور کامل rRNA را حذف کند. با این حال، این روش با مقادیر ورودی کم و نمونه های تخریب شده کار می کند.

بنابراین کدام روش تخلیه RNA ریبوزومی|ribosomal RNA depletion بهتر عمل می کند؟

بسته به روش تخلیه RNA انتخاب شده در تهیه کتابخانه RNA-Seq، برخی از تفاوت‌ها در ژن‌های شناسایی‌شده و سطوح بیان آن‌ها قطعا مشاهده خواهد شد.

انتخاب Poly-A زمانی که فقط بر روی ژن‌های کدکننده پروتئین تمرکز می‌کند، ممکن است کارآمدترین روش باشد، اما اطلاعات قابل توجهی در مورد RNA‌های غیر پلی‌آدنیله و رونوشت‌های نابالغ از دست می‌رود. در مواردی مانند توالی‌یابی میکروبی یا در توالی‌یابی نمونه های تخریب شده یا FFPE، انتخاب poly-A حتی نمی تواند اعمال شود یا ممکن است عملکرد ضعیفی داشته باشد.

حذف فیزیکی rRNA مزیت بازیابی اطلاعات ترانسکریپتومیک بیشتری را ارائه می‌کند، اما به قیمت خوانش‌های اینترونیک/بین‌ژنیک بیشتراست، که نیاز به عمق توالی بیشتری دارد. با این حال، انعطاف پذیری بیشتر و عملکرد بهتر در توالی انواع نمونه چالش برانگیز ارائه می دهد.

توسعه هدفمند با پرایمرهای “نه چندان تصادفی” اگرچه برای مواد ورودی کم موثر است، اما به عمق بیشتر توالی نیاز است.

همه روش‌ها در معرض تا حدودی غیر اختصاصی بودن و سوگیری تشخیص دارند. تنوع بیشتر نیز می تواند از روش های مختلف تراز توالی در تجزیه و تحلیل داده های RNA-Seq ناشی شود. بنابراین همیشه توصیه می‌شود داده‌های توالی‌یابی به‌دست‌آمده با PCR کمی در زمان واقعی ((rtqPCR یا روش‌های دیگر تأیید شوند.

تخلیه RNA ریبوزومی|ribosomal RNA depletion