توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing

RNA-seq چیست؟

توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing که به اختصار RNA-seqنامیده شده است، یک تکنیک توالی یابی بده که از توالی نسل بعدی NGS برای آشکار کردن حضور و کمیت RNA در یک نمونه بیولوژیکی در یک لحظه معین استفاده می کند و رونوشت سلولی که به طور مداوم در حال تغییر می‌باشد را بررسی می‌کند. این تکنیک نشان می دهد کدام یک از ژنهای رمزگذاری شده در DNA ما به چه میزان روشن یا خاموش شده است.

به کمک تکنولوژی  RNA-SEQ  بررسی رونوشت‌های ژن پردازش شده، اصلاحات پس از رونویسی ، همجوشی ژن ، جهش/SNP ها و تغییر در بیان ژن در طول زمان ، یا بررسی تفاوت در بیان ژن در گروه های مختلف تسهیل شده است. علاوه بر رونوشت‌های mRNA ، RNA-Seq می تواند جمعیت های مختلف RNA را بررسی کند که RNA  کل ، RNA کوچک مانند miRNA ، tRNA و پروفایل ریبوزومی را شامل می‌شود. RNA-Seq همچنین می تواند برای تعیین مرزهای اگزون/اینترون و تأیید یا اصلاح مرزهای ژن 5’ و‘3 که قبلاً شناسایی شده است، استفاده شود. پیشرفت های اخیر در RNA-Seq شامل توالی یابی یک سلول، توالی یابی درجا از بافت ثابت و توالی مولکول RNA طبیعی با توالی یابی یک تک مولکول به صورت real-time می باشد. نمونه های دیگر برنامه های در حال ظهور RNA-SEQ به دلیل پیشرفت الگوریتم های بیوانفورماتیک عبارتند از: تغییر تعداد کپی ، آلودگی میکروبی ، عناصر قابل انتقال ، نوع سلول (تجزیه) و حضور نئوآنتیژن‌ها.

قبل از RNA-SEQ ، مطالعات بیان ژن با ریزآرایه مبتنی بر هیبریداسیون انجام می‌گرفت. مسائل مربوط به ریزآرایه ها شامل مصنوعات هیبریداسیون متقاطع ، کمیت ضعیف ژنهای کم بیان شده و نیاز به دانستن توالی یک پیشینه از آن است. به دلیل این موضوعات فنی ، Transcriptomics به روش‌های مبتنی بر توالی منتقل می شود. این موارد از توالی یابی سانگر از کتابخانه های برچسب دار توالی بیان شده ، به روشهای مبتنی بر برچسب شیمیایی (به عنوان مثال ، تجزیه و تحلیل سریال بیان ژن) و در نهایت به فناوری فعلی ، توالی یابی نسل بعدی DNA مکمل ، به ویژه RNA-SEQ پیشرفت کرده است.

توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing

کاربردهای توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing چیست؟

RNA-Seq به ما این امکان را می دهد تا رونوشت کل سلولی RNA ها از جمله mRNA ، rRNA و tRNA را بررسی و کشف کنیم. RNA-Seq می تواند به ما بگوید که کدام ژن ها در یک سلول روشن می شوند ، میزان رونویسی آنها چیست و در چه مواقعی فعال می شوند یا خاموش می شوند که می‌تواند حاکی از یک بیماری باشد. برخی از محبوب ترین تکنیک هایی که از RNA-SEQ استفاده می کنند عبارتند از پروفایل رونویسی ، شناسایی پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) ، ویرایش RNA و تجزیه و تحلیل در انوع بیان ژن.

این تکنیک می تواند به محققان اطلاعات حیاتی در مورد عملکرد ژن ها را ارائه دهد. به عنوان مثال ، ترنسکریپتوم می تواند تمام بافت هایی را که در آن ژن دارای عملکرد ناشناخته روشن است ، برجسته کند ، که ممکن است نشان دهنده نقش آن باشد. همچنین اطلاعاتی در مورد وقایع ویرایش جایگزین ، که نسخه های مختلفی را از یک دنباله ژن واحد تولید می کند ، نشان دهد. این رویدادها با توالی یابی DNA مشخص نمی شوند. همچنین می تواند اصلاحات پس از رونویسی را که در طول پردازش mRNA مانند پلی آدنیلاسیون و پوشش 5’ انجام می شود را شناسایی کند.

توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing چگونه کار می کند؟

تکنیک های اولیه RNA-SEQ از فناوری توالی یابی سانگر استفاده می کردند ، تکنیکی که اگرچه در آن زمان نوآورانه نیز دارای توان کم و پرهزینه بود. اخیراً ، با ظهور و گسترش فناوری NGS ، ما توانسته ایم از پتانسیل RNA-Seq به طور کامل استفاده کنیم.

یک پروتوکل عملکردی برای RNA-Seq چندین مرحله دارد که می توان به این صورت خلاصه کرد:

• RNA extraction
• Reverse transcription into cDNA
• Adapted ligation
• Amplification
• Sequencing

پس از به دست آوردن نمونه RNA خود برای تجزیه و تحلیل ، اولین قدم در این تکنیک شامل تبدیل جمعیت RNA برای توالی یابی به DNA مکمل می‌باشد. این کار توسط رونویسی معکوس انجام می شود و اجازه می دهد تا RNA در یک فرآیند NGS قرار گیرد. سپس cDNA قطعه قطعه شده و آداپتورها به هر انتهای قطعات اضافه می شوند. این آداپتورها حاوی عناصر کاربردی هستند که به عنوان مثال ، عنصر تقویت کننده و جایگاه اولیه توالی یابی است. پس از فرآیندهای تقویت ، انتخاب اندازه ، پاکسازی و بررسی کیفیت ، کتابخانه cDNA توسط NGS مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد و توالی های کوتاه تولید می کند که مطابق با تمام یا بخشی از قطعه ای است که از آن گرفته شده است. عمق توالی کتابخانه بسته به هدفی که از داده های خروجی برای آن استفاده می شود متفاوت است. توالی ممکن است از روشهای توالی تک یا زوجی پیروی کند. توالی تک خواندن یک تکنیک ارزان تر و سریعتر (برای مرجع ، حدود 1 ٪ از هزینه توالی یابی سانگر) است که قطعات cDNA را فقط از یک انتها توالی یابی می‌کند. دنباله روشهای زوج از هر دو انتها گرانتر ازهستند اما مزایایی در بازسازی داده های پس از توالی ارائه می دهند.

انتخاب دیگری که باید بین پروتکل های خاص رشته و غیر رشته ای انجام شود. روش قبلی به معنای اطلاعاتی است که در مورد رونویسی از رشته DNA حفظ شده است. ارزش اطلاعات اضافی به دست آمده از پروتکل های خاص رشته ، آنها را به گزینه مطلوب تبدیل می کند.

این خوانده ها ، که در انتهای کار از این تعداد میلیون ها وجود خواهد داشت ، می توانند در صورت موجود بودن یا مونتاژ De novo با یک ژنوم مرجع تراز شوند تا نقشه توالی RNA را تولید کنند که رونوشت را شامل می شود.

توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing

توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing در مقابل ریزآرایه: چرا RNA-Seq برتر تلقی می شود؟

RNA-Seq به طور گسترده ای نسبت به سایر فن آوری ها ، مانند هیبریداسیون ریزآرایه‌ای ، برتر است. دلایل مختلفی برای وضعیت مورد توجه RNA-Seq وجود دارد:

• محدود به توالی های ژنومی- بر خلاف رویکردهای مبتنی بر هیبریداسیون ، که ممکن است به پروب های خاص گونه نیاز داشته باشد ، RNA-SEQ می تواند رونوشت های موجودات با توالی ژنومی که قبلاً نامشخص بوده است را تشخیص دهد. این امر باعث می شود که برای تشخیص رونوشت های جدید، SNP ها یا سایر تغییرات برتر باشد .

• سیگنال پس زمینه کم- توالی cDNA مورد استفاده در RNA-Seq را می توان در مناطق هدفمند روی ژنوم نقشه برداری کرد ، که باعث می شود حذف نویز آزمایش آسان شود.

• داده با قابلیت اندازه گیری بالا- داده های ریزآرایی فقط به عنوان مقادیر نسبت به سایر سیگنال های شناسایی شده در آرایه نمایش داده می شوند ، در حالی که داده های RNA -SEQ قابل اندازه گیری است. RNA-Seq همچنین از مشکلات ریزآرایه ها در تشخیص سطح رونویسی بسیار بالا یا بسیار پایین جلوگیری می کند.

تهیه کتابخانه cDNA

پس از در نظر گرفتن این نکات ، شروع به تهیه کتابخانه cDNA کرده. این امر به تکه تکه شدن cDNA ، افزودن “توالی آداپتور” خاص و تقویت cDNA نیاز دارد ، در این مرحله روش خاص و دقیقی متناسب با نمونه باید اتخاذ گردد. برای رشته خاص، تولید cDNA شامل سنتز رشته اول با واسطه رونویسی معکوس و به دنبال آن  سنتز رشته دوم با واسطه DNA پلیمراز است. همچنین ممکن است بارکدهایی اضافه شوند که امکان چند برابر شدن را فراهم می کنند، بنابراین نمونه‌های بی شماری را می توان در یک فرآیند توالی یابی کرد. برای اطمینان از موفقیت آمیز بودن پروتکل و بررسی کیفیت و غلظت کتابخانه، می توان کمیت کتابخانه را در پایان مرحله آماده سازی کتابخانه بررسی کرد تا توالی یابی به صورت بهینه عمل کند.

توالی یابی cDNA

پس از تهیه کتابخانه ، می توان از پلت فرم توالی یابی انتخابی استفاده کرده تا کتابخانه cDNA را مطابق خواسته ترتیب داد. پس از تولید داده های رونوشت، می توانید داده ها را به ژنوم مرجع خود نقشه برداری و تراز کرد یا در صورت عدم وجود مرجع ، آن را به صورت از نو جمع‌آوری کرد. مونتاژ De Novo علاوه بر مواردی که قبلاً شناخته شده اند ، کشف رونوشت های جدید را نیز امکان پذیر می‌کند.

توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing

تجزیه و تحلیل داده های توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing

پس از مرحله تراز ، می توانید روی تجزیه و تحلیل داده های خود تمرکز کنید. ابزارهایی مانند Sailfish ، RSEM و Bitseq13 به شما در تعیین میزان رونویسی خود کمک می کنند ، در حالی که ابزارهایی مانند MISO ، که ژنهای متناوب متناوب را تعیین می کنند ، برای تجزیه و تحلیل تخصصی تر در دسترس هستند. یک کتابخانه از این ابزارها در آنجا وجود دارد که خواندن بررسی ها و جمع بندی آنها، بهترین راه برای یافتن ابزار مناسب تحقیقات مورد نظراست.

چالش های توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing

پیشرفت چشمگیری در زمینه RNA-Seq طی یک دهه گذشته انجام شده است. در حالی که عملکرد آن افزایش یافته است ، هزینه های مرتبط به میزان قابل توجهی کاهش یافته است ، درستی توالی در تکنیک بسیار برتر از تکرارهای قبلی فن آوری های NGS است و در دسترس بودن ابزارهای تجزیه و تحلیل داده ها به طرز چشمگیری بهبود یافته است. با این حال ، دانشمندان در هنگام بررسی آزمایش های RNA-Seq با بسیاری از چالش ها رو‌به‌رو هستند که شامل:

• جداسازی RNA با کیفیت بالا- در حالی که مقدار نمونه مورد نیاز برای تجزیه و تحلیل RNA-SEQ به طرز چشمگیری کاهش یافته است ، هنوز هم مهم است که اطمینان حاصل کنید که شما می توانید RNA کافی را برای تحقق تمام الزامات تجزیه و تحلیل خود ، از جمله تکرارها در صورت لزوم بدست آورید. همچنین باید در نظر داشته باشید که ، در حالی که ممکن است RNA کل را جدا کنید ، بسته به سؤال تجربی شما ، احتمالاً فقط می توانید بخشی از نمونه را توالی یابی کنید (به طور معمول RNA پیام رسان (mRNA ، و بیشتر مقدار نمونه کاهش می یابد. این مقدار نمونه باید از کیفیت و خلوص بالا برخوردار باشد زیرا نمونه های ضعیف به نتایج ضعیف منجر می شوند ، یا در برخی موارد موجب عدم موفقیت در پروتکل آماده سازی کتابخانه می‌شود. کیفیت و غلظت RNA را می توان با استفاده از طیف سنجی UV  تعیین کرد. بر خلاف DNA ، RNA به سرعت تخریب می شود ، بنابراین مهم است که نمونه ها را با مراقبت در تمام مراحل انزوا و تصفیه مراقبت کنید. تخریب ممکن است یکنواخت نباشد و مانع مقایسه سطح رونویسی بین ژن ها شود. رونوشت‌های سطح پایین ممکن است از جمعیت توالی به طور کلی از بین بروند.

• تأثیرجمع آوری نمونه – یکی کردن نمونه های جمع آوری قبل از تهیه کتابخانه (بدون استفاده از بارکد سازی) می‌تواند تلاش و هزینه های توالی یابی را کاهش دهد یا توالی یابی را در مواردی که مقادیر نمونه بسیار محدود هستند، ممکن سازد. با این حال ، مهم است که در طول تجزیه و تحلیل داده ها تمامی مقادیربه حساب بیایند ، با این که یکی از این نمونه های جمع آوری شده به عنوان یک تکرار بیولوژیکی در نظر گرفته می شود ، اما بسیاری از نمونه ها درنمونه ی جمع آوری شده وارد نشده اند. تغییرات بین نمونه های جمع شده می تواند منجر به نتایج گمراه کننده و مسائل آماری شود که باید پیامدهای احتمالی آن در طی فرآیند طراحی آزمایشی در نظر گرفته شود.

• عمق توالی یابی قطعات در برابر تعداد نمونه- ممکن است جذاب به نظر برسد که تعداد زیادی از نمونه ها در یک فرآیند توالی یابی انجام شود تا ممکن است هزینه ها و زمان را کاهش دهد. با این حال، این با هزینه ای همراه است. هرچه تعداد نمونه‌ها بیشترشود ، برای هر یک از این نمونه ها تعداد خوانش کمتر می شود. با کاهش عمق خواندن ، عدم قطعیت در مورد قابل اطمینان بودن توالی های به دست آمده است. فن آوری های توالی یابی هنوز بسیار کامل و عالی نیستند و اشتباهاتی در خوانش انجام می‌دهند. بنابراین مهم است که نقطه عطف بین به دست آوردن عمق خوانش کافی برای اعتماد به کیفیت و درستی داده های توالی به دست آمده و به حداکثر رساندن ظرفیت توالی یابی برای اطمینان از تکرارهای بیولوژیکی کافی برای ارائه داده های معنی دار را پیدا کنید.

مزایای توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing

• دامنه پویا بسیار گسترده ای را پوشش می دهد.
• اندازه گیری حساس و دقیقی از بیان ژن را ارائه می دهد.
• هر دو ویژگی شناخته شده و جدید را ارائه می کند. نیازی به پروب های از پیش تعیین شده ندارد.
• داده های کیفی و کمی را تولید می کند.
• رونوشت کامل را نشان می دهد ، نه فقط چند نسخه انتخاب شده.
• حتی اگر یک توالی مرجع در دسترس نباشد ، می تواند برای هر گونه از نو اعمال شود.

آیا توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing کمی است؟

بله ، RNA-Seq روشی به خوبی تثبیت شده و پذیرفته شده برای تعیین کمیت بیان ژن است.

تفاوت بین توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing و Transcriptomics چیست؟

Transcriptomics به طور گسترده به مطالعه RNA مربوط به سطح بیان ، عملکرد ، ساختار و تنظیم آن اشاره دارد. RNA-Seq خاص تر است و به تکنیک برای مطالعه توالی و کمیت RNA اشاره دارد.

عمق توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing چیست؟

عمق توالی یابی RNA نسبت تعداد کل پایه های بدست آمده با توالی به اندازه ژنوم یا میانگین تعداد دفعات اندازه گیری هر پایه در ژنوم است.

توده توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing چیست؟

توده RNA-Seq روشی است که RNA را از سلول ها یا بافت ها تجزیه و تحلیل می کند.

رشته RNA-Seq یا توالی یابی RNA رشته ای چیست؟

توالی یابی توالی RNA به محققان این امکان را می دهد تا تعیین کنند که یک رونوشت DNA (sense یا  anti-sense) است. در مقایسه با روشهای منظم توالی یابی RNA ، توالی یابی RNA رشته ای می‌توان رونوشت های جدید را پیدا کند ، رونوشت ها را از ژن های همپوشانی متمایز کرد ، توالی های ضد حساس و ژنهای از قبل شناخته شده را پیدا کرد.

چگونه آماده سازی mRNA ، RNA کل و کتابخانه متفاوت است؟

در روش های تهیه کتابخانه mRNA ، mRNA از طریق دانه های oligodT از کل RNA انتخاب می‌شود ، بنابراین کتابخانه ها فقط از رونوشت های پلی آدنیله تهیه می شوند. در کل RNA ، rRNA و سایر رونوشت های فراوان از نمونه ها جدا می شوند ، و RNA های باقیمانده در کتابخانه های توالی یابی ، از جمله RNA های پلی آدنیله و غیر پلی آدنیله تهیه می شوند. در کتابخانه ها از همه نمونه های RNA تهیه می شوند. این كتابخانه ها متعاقباً با استفاده از پانل پروب الیگو غنی می شوند. پانل ها  می‌توانند ازاگزوم های کد گذاری شده، رونوشت های مرتبط با بیماری های خاص ، RNA از پاتوژن ها یا اهداف سفارشی را هدف قرار دهند.

توالی یابی کامل آر ان ای | Total RNA-Sequencing