توالی یابی چیپ | Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq)

توالی‌یابی بر اساس رسوب گذاری ایمنی کروماتین

با ترکیب سنجش رسوب گذاری ایمنی کروماتینChIP  با توالی یابی، تعیین توالی بر اساس ChIP-Seq  یک روش قدرتمند برای شناسایی مکان های اتصال DNA در سطح ژنوم برای فاکتورهای رونویسی و سایر پروتئین ها است. با پیروی از پروتکل‌های رسوب گذاری ایمنی کروماتین، پروتئین متصل به DNA با استفاده از یک آنتی‌بادی خاص رسوب گذاری ایمنی می‌شود. سپس DNA متصل شده همزمان رسوب داده، خالص شده و توالی یابی می‌گردد.

استفاده از توالی یابی نسل بعدی NGS در رسوب گذاری ایمنی کروماتین بینش هایی را در مورد رویدادهای تنظیم ژن که در بیماری ها و مسیرهای بیولوژیکی مختلف، مانند توسعه و پیشرفت سرطان نقش دارند، نشان داده است. ChIP-Seq بررسی کامل برهمکنش‌های بین پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک را در مقیاس وسیع ژنوم ممکن می‌سازد.

کاربرد توالی یابی چیپ | Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-seq در درجه اول برای تعیین اینکه چگونه فاکتورهای رونویسی و سایر پروتئین های مرتبط با کروماتین بر مکانیسم های تأثیرگذار بر فنوتیپ تأثیر می گذارند استفاده می شود. تعیین نحوه تعامل پروتئین ها با DNA برای تنظیم بیان ژن برای درک کامل بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی و حالات بیماری ضروری است. این اطلاعات اپی ژنتیکی مکمل آنالیز ژنوتیپ و بیان است. فناوری Chip-seq در حال حاضر اساساً به عنوان جایگزینی برای ChIPکه نیاز به یک آرایه هیبریداسیون دارد دیده می شود. مکان‌های خاص DNA در تعامل فیزیکی مستقیم با فاکتورهای رونویسی و سایر پروتئین‌ها را می‌توان با رسوب گذاری ایمنی کروماتین جدا کرد. ChIP کتابخانه ای از سایت های DNA هدف متصل به پروتئین مورد نظر را تولید می کند. آنالیزهای توالی موازی انبوه همراه با پایگاه های داده توالی کل ژنوم برای تجزیه و تحلیل الگوی تعامل هر پروتئین با DNA،  یا الگوی هر گونه تغییرات کروماتین اپی‌ژنتیکی استفاده می شود. این را می توان برای مجموعه ای از پروتئین های دارای رسوب گذاری ایمنی کروماتین اعمال کرد، مانند فاکتورهای رونویسی، پلیمرازها و ماشین های رونویسی، پروتئین های ساختاری، اصلاحات پروتئین، و اصلاحات DNA. به‌عنوان جایگزینی برای وابستگی به آنتی‌بادی‌های خاص، روش‌های مختلفی برای یافتن مجموعه تمام نواحی تنظیم‌کننده فعال فاقد نوکلئوزوم یا اختلال در نوکلئوزوم در ژنوم، مانند DNase-Seqو FAIRE-Seq توسعه یافته‌اند.

روش کارتوالی یابی چیپ | Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq)

رسوب گذاری ایمنی کروماتین یک روش قدرتمند برای غنی‌سازی انتخابی توالی‌های DNA متصل به پروتئین خاص در سلول‌های زنده است. با این حال، استفاده گسترده از این روش به دلیل عدم وجود یک روش به اندازه کافی قوی برای شناسایی تمام توالی های DNA غنی شده محدود شده است. پروتکل Chip wet lab حاوی رسوب گذاری ایمنی کروماتین و هیبریداسیون است. اساساً پنج بخش در پروتکل رسوب گذاری ایمنی کروماتین وجود دارد که به درک بهتر فرآیند کلی رسوب گذاری ایمنی کروماتین کمک می کند. به منظور انجام رسوب گذاری ایمنی کروماتین، اولین مرحله پیوند متقابل با استفاده از فرمالدئید و دسته‌های بزرگ DNA به منظور به دست آوردن مقدار مفید است. پیوندهای متقابل بین پروتئین و DNA و همچنین بین RNA و سایر پروتئین ها ایجاد می شود. مرحله دوم فرآیند تکه تکه شدن کروماتین است که کروماتین را تجزیه می کند تا در پایان قطعات DNA با کیفیت بالا برای تجزیه و تحلیل رسوب گذاری ایمنی کروماتین بدست آید. این قطعات باید به گونه ای برش داده شوند که هر کدام زیر 500 جفت باز شوند تا بهترین نتیجه را برای نقشه برداری ژنوم داشته باشند. مرحله سوم، رسوب ایمنی کروماتین نامیده می شود، که همان چیزی است که ChIP مخفف آن است. فرآیند رسوب گذاری ایمنی کروماتین، کمپلکس‌های پروتئینی DNA با پیوند متقابل خاص را با استفاده از یک آنتی‌بادی علیه پروتئین مورد نظر و به دنبال آن انکوباسیون و سانتریفیوژ برای به دست آوردن رسوب ایمنی افزایش می‌دهد. مرحله رسوب گذاری ایمنی همچنین امکان حذف مکان های اتصال غیر اختصاصی را فراهم می کند. مرحله چهارم بازیابی و خالص سازی DNA است که با اثر معکوس بر پیوند متقابل بین DNA و پروتئین برای جداسازی آنها و پاکسازی DNA با استخراج انجام می شود. مرحله پنجم و نهایی، مرحله تجزیه و تحلیل پروتکل رسوب گذاری ایمنی کروماتین توسط فرآیند qPCR، چیپ روی رسوب گذاری ایمنی کروماتین (آرایه هیبریدی) یا توالی یابی رسوب گذاری ایمنی کروماتین است. سپس آداپتورهای الیگونوکلئوتیدی به بخش‌های کوچک DNA که به پروتئین مورد نظر متصل شده‌اند اضافه می‌شوند تا توالی‌یابی موازی انبوه را امکان‌پذیر کنند. از طریق تجزیه و تحلیل، می توان توالی ها را توسط ژن یا ناحیه ای که پروتئین به آن متصل شده است شناسایی و تفسیر کرد.

توالی یابی چیپ | Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq)

پس از انتخاب اندازه، تمام قطعات ChiP-DNA حاصل به طور همزمان با استفاده از یک توالی سنجی ژنوم توالی یابی می شوند. یک اجرای توالی یابی واحد می تواند ارتباط های گسترده ژنوم را با وضوح بالا اسکن کند، به این معنی که ویژگی ها می توانند دقیقاً روی کروموزوم ها قرار گیرند. چیپ روی رسوب گذاری ایمنی کروماتین ، در مقابل، به مجموعه های بزرگی از آرایه های بخش بندی شده برای وضوح کمتر نیاز دارد.

روش های جدید توالی یابی زیادی در این مرحله توالی یابی استفاده می شود. برخی از فناوری‌هایی که توالی‌ها را تجزیه و تحلیل می‌کنند، می‌توانند از تقویت خوشه‌ای قطعات DNA رسوب گذاری ایمنی کروماتین متصل به آداپتور بر روی یک بستر سلولی جریان جامد برای ایجاد خوشه‌هایی با تقریباً 1000 کپی کلونال استفاده کنند. آرایه‌ای با چگالی بالا از خوشه‌های الگو بر روی سطح سلول جریان توسط یک برنامه تجزیه و تحلیل ژنوم توالی‌یابی می‌شود. هر خوشه الگو به طور موازی با استفاده از نوکلئوتیدهای پایان‌دهنده برگشت‌پذیر برچسب‌گذاری‌شده با فلورسنت، تحت توالی‌یابی با سنتز قرار می‌گیرد. در طول هر خواندن، الگوها به صورت پایه به پایه ترتیب بندی می شوند. سپس، نرم‌افزار جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل داده‌ها، توالی‌های نمونه را با یک توالی ژنومی شناخته‌شده تراز می‌کند تا قطعات ChIP-DNA را شناسایی کند.

مزایای توالی یابی چیپ | Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq)

برخلاف آرایه‌ها و سایر روش‌های مورد استفاده برای بررسی اپی ژنوم، که ذاتاً سوگیری دارند زیرا به کاوشگرهای مشتق شده از توالی‌های شناخته شده نیاز دارند، ChIP-Seq به دانش قبلی نیاز ندارد. ChIP-Seq پروفایل گسترده ژنوم را با توالی موازی انبوه ارائه می دهد و میلیون ها شمارش را در چندین نمونه برای بررسی مقرون به صرفه، دقیق و بی طرفانه از الگوهای اپی ژنتیک ایجاد می کند. مزایای دیگر عبارتند از:

• اهداف DNA را برای فاکتورهای رونویسی یا تغییرات هیستون در کل ژنوم هر موجود زنده می‌گیرد.
• مکان های اتصال فاکتور رونویسی را تعریف می کند.
• شبکه های تنظیم کننده ژن را در ترکیب با توالی یابی RNA و تجزیه و تحلیل متیلاسیون نشان می دهد.
• سازگاری با نمونه های مختلف DNA ورودی را ارائه می دهد.