توالی یابی بی سولفیت | Bisulfite Sequencing

متیلاسیون DNA یک مکانیسم اپی ژنتیکی است که در تنظیم ژن پستانداران، نقش‌بندی ژنومی و سرکوب عناصر قابل انتقال نقش دارد. الگوهای متیلاسیون را می‌توان با بررسی مکان‌های خاص یا از طریق پروفایل متیلاسیون در سطح ژنوم مشخص کرد. تیمار با بی‌سولفیت روش استاندارد طلایی برای تعیین متیلاسیون DNA در نظر گرفته می شود.

توالی یابی بی سولفیت (BS-seq) توالی یابی بی سولفیت کل ژنوم (WGBS ) یک پروتکل به خوبی تثبیت شده برای تشخیص سیتوزین‌های متیله در DNA ژنومی است. در این روش، DNA ژنومی با بی سولفیت سدیم تیمار می‌شود و سپس توالی‌یابی می‌شود و وضوح تک‌پایه سیتوزین‌های متیله در ژنوم ارائه می‌شود. بی‌سولفیت، سدیم سیتوزین‌های اصلاح نشده را به اوراسیل دآمینه می‌کند اما بر 5-متیل سیتوزین‌ها تأثیر نمی‌گذارد. سپس DNA تیمار شده با بی‌سولفیت توسط PCR تکثیر می‌شود که طی آن 5- متیل سیتوزین‌ها به عنوان سیتوزین و اوراسیل‌ها به عنوان تیمین تقویت می‌شوند. سپس می‌توان از توالی‌یابی DNA برای روشن کردن وضعیت متیلاسیون یک منطقه مورد نظر یا کل ژنوم در وضوح تک نوکلئوتیدی استفاده کرد. تکثیر DNA تیمار شده با بی‌سولفیت به آنزیمی نیاز دارد که بتواند DNA حاوی اوراسیل و قسمت های غنی از AT را تحمل کند (تبدیل سیتوزین های اصلاح نشده به تیمین باعث افزایش نسبت AT  در DNA هدف می شود). تیمار بی سولفیت DNA، سیتوزین های متیله نشده را به تیمیدین تبدیل می کند که منجر به کاهش پیچیدگی توالی می شود. توالی یابی عمیق بسیار دقیق برای کاهش این پیچیدگی کار می کند.

محدودیت های توالی یابی بی سولفیت | Bisulfite Sequencing

5-هیدروکسی متیل سیتوزین

توالی یابی بی سولفیت به طور گسترده در ژنوم پستانداران استفاده می شود، با این حال با کشف یک اصلاح جدید DNA پستانداران 5-هیدروکسی متیل سیتوزین، عوارضی ایجاد شده است.5-هیدروکسی متیل سیتوزین پس از تیمار بی سولفیت به سیتوزین-5-متیل سولفونات تبدیل می شود که پس از تعیین توالی به صورت C خوانده می شود. بنابراین، تعیین توالی بی سولفیت نمی تواند بین 5-متیل سیتوزین و 5-هیدروکسی متیل سیتوزین تمایز قائل شود. این بدان معنی است که خروجی از توالی یابی بی سولفیت دیگر نمی تواند صرفاً به عنوان متیلاسیون DNA تعریف شود، زیرا ترکیبی از 5-متیل سیتوزین و 5-هیدروکسی متیل سیتوزین است.

تبدیل ناقص در توالی یابی بی سولفیت | Bisulfite Sequencing

توالی یابی بی سولفیت بر تبدیل هر باقی مانده سیتوزین متیله نشده به اوراسیل متکی است. اگر تبدیل ناقص باشد، تجزیه و تحلیل بعدی به اشتباه سیتوزین های متیله نشده تبدیل نشده را به عنوان سیتوزین های متیله تفسیر می کند و در نتیجه نتایج مثبت کاذب برای متیلاسیون به دست می آید. فقط سیتوزین‌های موجود در DNA تک رشته‌ای مستعد حمله بی سولفیت هستند، بنابراین دناتوره‌سازی DNA تحت آنالیز حیاتی است.مهم است که اطمینان حاصل شود که پارامترهای واکنش مانند دما و غلظت نمک برای حفظ DNA در یک ترکیب تک رشته ای مناسب هستند و امکان تبدیل کامل را فراهم می کنند. گزارش شده است که قرار دادن DNA در ژل آگارز باعث بهبود سرعت تبدیل با جدا نگه داشتن رشته‌های DNA از نظر فیزیکی می‌شود.

تخریب DNA در طی تیمار بی سولفیت توالی یابی بی سولفیت | Bisulfite Sequencing

چالش اصلی در توالی یابی بی سولفیت، تخریب DNA است که همزمان با تبدیل صورت می گیرد. شرایط لازم برای تبدیل کامل، مانند زمان انکوباسیون طولانی، درجه حرارت بالا و غلظت بالای بی سولفیت، می تواند منجر به تخریب حدود 90 درصد از DNA انکوبه شده شود. با توجه به اینکه مقدار اولیه DNA اغلب محدود است، چنین تخریب گسترده‌ای می تواند مشکل ساز باشد. تخریب به صورت دپوریناسیون رخ می دهد که منجر به گسست تصادفی رشته می‌شود. بنابراین، هرچه آمپلیکون PCR مورد نظر طولانی‌تر باشد، تعداد مولکول‌های الگوی دست‌نخورده محدودتر خواهد بود. این می تواند منجر به شکست در تقویت PCR، یا از دست دادن اطلاعات کمی دقیق در مورد سطوح متیلاسیون ناشی از نمونه برداری محدود از مولکول‌های الگو شود. بنابراین، ارزیابی میزان تخریب DNA ناشی از شرایط واکنش به کار گرفته شده، و در نظر گرفتن اینکه چگونه این امر بر آمپلیکون مورد نظر تأثیر می گذارد، مهم است. همچنین می‌توان از تکنیک‌هایی برای به حداقل رساندن تخریب DNA استفاده کرد، مانند چرخه‌ای ‌کردن دمای انکوباسیون.

یک مشکل بالقوه مهم پس از تیمار بی سولفیت، سولفون زدایی ناقص باقیمانده های پیریمیدین به دلیل قلیایی شدن ناکافی محلول است. این ممکن است برخی از DNA پلیمرازها را مهار کند و PCR بعدی را دشوار کند. با این حال، می توان از این وضعیت با نظارت بر pH محلول جلوگیری کرد تا اطمینان حاصل شود که سولفوناسیون کامل خواهد شد.

نگرانی نهایی این است که تیمار بی سولفیت تا حد زیادی سطح پیچیدگی نمونه را کاهش می دهد، که در صورت انجام چندین واکنش PCR می تواند مشکل ساز باشد. طراحی پرایمر دشوارتر است و هیبریداسیون متقابل نامناسب بیشتر است.

مزایای توالی یابی بی سولفیت | Bisulfite Sequencing

متیلاسیون CpG و غیر CpG در سراسر ژنوم با وضوح تک پایه پوشانده می شود.

CpG: سایت های CpG یا سایت های CG مناطقی از DNA هستند که در آن نوکلئوتید سیتوزین توسط یک نوکلئوتید گوانین در توالی خطی بازها در امتداد جهت 3′ → 5′ دنبال می شود. سایت های CpG با فرکانس بالا در مناطق ژنومی به نام جزایر CpG یا جزایر CG رخ می دهد.

5- متیل سیتوزین‌ها در نواحی متراکم، کم تراکم و تکرار پوشیده شده است.

معایب توالی یابی بی سولفیت | Bisulfite Sequencing

بی سولفیت سیتوزین‌های متیله نشده را به تیمیدین تبدیل می کند و پیچیدگی توالی را کاهش می‌دهد که می‌تواند ایجاد هم ترازی را دشوار کند.

نانوذراتی که در آن سیتوزین به تیمیدین تبدیل می شود، پس از تبدیل بی سولفیت از دست می رود.

تبدیل بی سولفیت بین 5- متیل سیتوزین‌ها و 5-هیدروکسی متیل سیتوزین تفاوتی ندارد.

توالی یابی بی سولفیت | Bisulfite Sequencing