بررسی اجمالی فناوری RNA-Seq

فن آوری توالی یابی(RNA-Seq) RNA  ساخت پروفایل و بررسی عمیق و دقیق رونوشت را برای تمامی جاندار داران امکان پذیر می کند. این رویکرد در مقایسه با Microarray یا ریزآرایه، که یک فناوری قدیمی بوده و اغلب در مطالعات بیان ژن مورد استفاده قرار می‌گیرد، مزایای زیادی دارد.

مزایای فناوری RNA-Seq در مقابل Microarray

1. توانایی تشخیص رونوشت‌های جدید: برخلاف Microarray ، فناوری RNA-Seq به پروب‌های خاص یک گونه یا رونوشت نیاز ندارد و می‌تواند رونوشت‌های جدید، همجوشی‌های ژنی، انواع تغییرات تک نوکلئوتیدی، Indels (درج‌ها و حذف‌های کوچک) و سایر تغییرات ناشناخته قبلی را که Microarray نمی‌تواند تشخیص دهد، شناسایی کند.
2. محدوده گسترده تر: با فناوری هیبریداسیون Microarray ، اندازه گیری بیان ژن به وسیله نویز پس زمینه و اشباع سیگنال (سطح بالای نور ساطع شده از پروب ها که توسط آشکارساز دستگاه قابل دریافت نیست) محدود می شود. اما در فناوری RNA-Seq تفاوتی ویژه ای بین خواندش های دیجیتالی توالی و خوانش های واقعی وجود دارد که می‌تواند بیان را در محدوده بزرگ‌تر کمی کند. (بیش از 10⁵ برای RNA-Seq در مقابل 10³ برای آرایه‌ها).
3. اختصاصیت و حساسیت بیشتر: در مقایسه با Microarray، فناوری RNA-Seq می‌تواند درصد بیشتری از ژن‌های بیان شده متفاوت، به‌ویژه ژن‌هایی با بیان کم را شناسایی کند.
4. تشخیص ساده رونوشت های با مقدار کم: عمق پوشش توالی یابی را می توان به راحتی افزایش داد تا رونوشت های نادر، رونوشت های منفرد در هر سلول، یا ژن های ضعیف بیان شده را شناسایی کرد.

تفاوت بین NGS و qPCR

هنگام مقایسه توالی یابی نسل جدید (NGS) در مقابل فناوری های qPCR، تفاوت اصلی در قدرت کشف است. در حالی که هر دو روش، امکان تشخیصی بسیار حساس و قابل اعتماد را ارائه می دهند، qPCR فقط می تواند توالی های شناخته شده را تشخیص دهد، در مقابل، NGS یک رویکرد بدون فرضیه قبلی است که نیازی به دانش قبلی از اطلاعات توالی ندارد و همچنین قدرت اکتشاف بالاتری را برای شناسایی ژن‌های جدید و حساسیت بالاتری برای تعیین کمیت انواع نادر و رونوشت‌ها فراهم می‌کند.

فناوری‌های NGS در مقابل qPCR در مقیاس‌پذیری و توان عملیاتی متفاوت هستند. در حالی که qPCR برای تعداد هدف کم موثر است و انجام کار برای چندین هدف می تواند دشوار باشد، اساسا NGS برای مطالعات با اهداف یا نمونه های زیاد طراحی شده و ترجیح داده می شود. یک آزمایش NGS می تواند واریانت های مختلفی را در هزاران منطقه هدف با وضوح در حد تک باز شناسایی کند.

مقایسه تفصیلی  NGS و qPCR

مزایای RNA-Seq در مقابل qPCR

1. qRT-PCR برای تعیین کمی بیان چند ژن مفید است و فقط می تواند توالی های شناخته شده را تشخیص دهد. اما به این دلیل که RNA-Seq به پروب های از پیش طراحی شده نیاز ندارد می تواند هر دو نوع رونوشت های شناخته شده و جدید را شناسایی کند.
2. به منظور تعیین دقیق تعداد رونوشت ها یا کمی سازی بیان ژن، مانند بررسی پروفایل بیان ژن، ماهیت دیجیتالی NGS یک محدوده دینامیک برای میزان خوانش ها به میزان تقریبا بی نهایت ایجاد می کند. درواقع RNA-Seq تعداد دفعات خوانده شدن توالی منفرد را از یک توالی مرجع مشخص می کند و مقادیر بیان مطلق به جای نسبی را اعلام می کند. این محدوده دینامیکی گسترده، تشخیص تغییرات ظریف در بیان، تا 10٪ را امکان پذیر می کند.

چه زمانی از NGS بجای qPCR استفاده کنیم؟

انتخاب بین NGS و qPCR به عوامل متعددی از جمله تعداد نمونه ها، مقدار کل توالی در مناطق هدف، ملاحظات بودجه و اهداف مطالعه بستگی دارد. زمانی که تعداد مناطق هدف کم است (20 هدف) و زمانی که اهداف مطالعه به غربالگری یا شناسایی انواع شناخته شده محدود می شود، معمولاً qPCR انتخاب خوبی است، در غیر این صورت، NGS بیشتر با نیازهای شما مطابقت دارد.

با توانایی توالی یابی چندین ژن در چندین نمونه به طور همزمان، روش های هدفمند NGS در مقایسه با روش های تکراری سنتی در زمان و منابع صرفه جویی می کنند. NGS همچنین قدرت کشف بالاتری را ارائه می‌کند و امکان تشخیص انواع جدید را فراهم می‌کند.

تفاوت بین NGS و Sanger Sequencing

در واقع، مفاهیم پشت فن‌آوری‌های سنگر و توالی‌یابی نسل جدید (NGS) مشابه است. در هر دو توالی یابی NGS و Sanger (همچنین به عنوان توالی یابی دی اکسی یا الکتروفورز کاپیلاری نیز شناخته می شود)، DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای فلورسنت را یکی یکی به یک رشته الگوی DNA در حال رشد اضافه می کند و هر نوکلئوتید ترکیب شده با برچسب فلورسنت اختصاصی خود شناسایی می شود.

تفاوت اساسی بین توالی یابی Sanger و NGS حجم توالی یابی است. در حالی که روش سانگر فقط یک قطعه DNA را در یک زمان مشخص توالی‌یابی می‌کند، NGS به طور گسترده و موازی میلیون‌ها قطعه را به طور همزمان در هر اجرا توالی‌یابی می‌کند و این فرآیند به تعیین توالی صدها تا هزاران ژن در یک زمان تبدیل می شود. NGS همچنین قدرت کشف بیشتری برای تشخیص انواع جدید یا نادر با توالی‌یابی عمیق ارائه می‌کند.

مزایای NGS در مقابل Sanger Sequencing

حساسیت بالاتر برای تشخیص واریانت ها با فراوانی پایین

سرعت بالاتر برای حجم نمونه بیشتر

پوشش ژنومی جامع

حد استانه تشخیصی بسیار بالا

ظرفیت بالاتر برای نمونه های مالتی پلکس

توانایی توالی یابی صدها تا هزاران ژن یا ناحیه ژنی به طور همزمان

مقایسه توالی سنگر و NGS

زمان استفاده از NGS و توالی سانگر

توالی یابی سنگر می تواند انتخاب خوبی باشد زمانی که بر روی ناحیه کوچکی از DNA در تعداد محدودی از نمونه ها یا اهداف ژنومی (~20 یا کمتر) کار می کنیم. در غیر این صورت، Targeted NGS به احتمال زیاد با نیازهای شما مطابقت دارد. NGS به شما امکان می دهد نمونه های بیشتری را به صورت مقرون به صرفه غربال کنید و واریانت های متفاوتی را در مناطق هدف ژنوم شناسایی کنید، رویکردی که با استفاده از توالی سنجی Sanger پرهزینه و وقت گیر خواهد بود.