۳ گروه اصلی از محیط کشت های کاربردی

محیط های کشت محیط هایی هستند که مواد مغذی و مواد معدنی و شرایط ضروری را برای حمایت از رشد سلول های جانوری، گیاهی و میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه فراهم می کنند. در ادامه به طور اجمالی محیط کشت های مختلف مربوط به هرکدام از این گروهها را مورد بررسی قرار خواهیم داد.

• محیط کشت میکروبی
• محیط کشت سلول های جانوری
• محیط کشت گیاهی

جهت دریافت هرگونه مشاوره خرید محیط کشت جانوری، باکتریایی و گیاهی با کارشناسان کیاژن فناور همراه باشید.

محیط کشت میکروبی

محیط های کشت محیط هایی هستند که مواد مغذی و مواد معدنی ضروری را برای حمایت از رشد سلول و میکروارگانیسم  ها در آزمایشگاه فراهم می کنند. انواع سلول ها و میکروارگانیسم  ها دارای ماهیت، ویژگی ها، زیستگاه و حتی نیازهای تغذیه ای متفاوتی هستند، بنابراین کشت آنها با یک نوع محیط کشت غیرممکن است. با این حال، کشت میکروارگانیسم  ها برای تشخیص بیماری های عفونی، به دست آوردن آنتی ژن، توسعه سنجش های سرولوژیکی برای واکسن ها، مطالعات ژنتیکی و شناسایی گونه های میکروبی ضروری است. علاوه بر این، برای جداسازی کشت های خالص، ذخیره ذخایر کشت، مطالعه واکنش های بیوشیمیایی، آزمایش آلودگی میکروبی، بررسی عوامل ضد میکروبی و اثرات نگهدارنده، آزمایش تعداد زنده و تست حساسیت آنتی بیوتیکی نیز ضروری است.

طبقه بندی و انواع محیط های کشت

رشد میکروارگانیسم ‌ها در آزمایشگاه شامل تقلید از زیستگاه یا محیط طبیعی موجودات است و این امر در آزمایشگاه با فرمول‌بندی محیط‌های کشت که نیازهای آن‌ها را برآورده می‌کند امکان‌پذیر است. بنابراین، بسیاری از محیط‌های کشت بر اساس گونه‌های میکروبی که قرار است کشت شوند، توسط دانشمندان ساخته شد. محیط کشت اصلی حاوی منبع کربن و انرژی، منبع نیتروژن، فاکتورهای رشد و برخی عناصر کمیاب است. برخی از اجزای محیط های کشت رایج شامل پپتون، آگار، آب، هیدرولیز کازئین، عصاره مالت، عصاره گوشت و عصاره مخمر هستند. علاوه بر این، pH محیط نیز باید بر اساس آن تنظیم شود. با این حال، برخی از اجزای اضافی یا مواد مغذی هنگام رشد میکروارگانیسم ‌های خاص به محیط اضافه می‌شوند.

محیط های کشت را می توان به سه روش طبقه بندی کرد: بر اساس قوام، جزء تغذیه ای و کاربرد.

الف- طبقه بندی محیط های کشت بر اساس سازگاری

1. محیط جامد: در این محیط ها آگار که یک زنجیره بلند و بدون انشعاب از پلی ساکاریدها است با غلظت 1.5-2.0 درصد اضافه می شود. معمولاً از 1.3% آگار برای تهیه محیط جامد در آزمایشگاه استفاده می شود. محیط حاوی آگار در دمای 37 درجه سانتیگراد جامد می شود. گاهی در محل آگار از برخی مواد جامد کننده بی اثر دیگر مانند صمغ ژلان استفاده می شود. محیط‌های جامد برای رشد میکروارگانیسم ‌ها به شکل فیزیکی کامل، تهیه کشت خالص باکتریایی، یا جداسازی باکتری‌ها برای مطالعه ویژگی‌های کلنی استفاده می‌شوند. رشد باکتری در محیط جامد از نظر ظاهری به صورت مخاطی، گرد، صاف، ناهموار، رشته ای، نامنظم و منفذی شکل متفاوت است. محیط توسط میکروارگانیسم ها هیدرولیز نمی شود و عاری از مواد بازدارنده رشد است. نمونه هایی از محیط های جامد عبارتند از: آگار خون، آگار مغذی، آگار مک کانکی و آگار شکلاتی.
2. محیط نیمه جامد: این محیط دارای غلظت 0.2-0.5 درصد آگار است و به دلیل کاهش غلظت آگار به صورت یک ماده نرم و ژله مانند ظاهر می شود. عمدتاً برای مطالعه تحرک میکروارگانیسم ‌ها، تمایز بین سویه‌های باکتریایی متحرک و غیر متحرک) از طریق لوله U و Cragie’s tube ) و پرورش باکتری‌های میکروآئروفیل استفاده می‌شود – باکتری‌ها در این محیط به صورت یک خط ضخیم ظاهر می‌شوند. نمونه هایی از محیط های نیمه جامد عبارتند از: محیط تخمیر اکسیداسیون هیو و لیفسون، محیط های استوارت و آمیز و محیط های تحرک مانیتول.
3. محیط های مایع: این محیط ها هیچ گونه اثری از مواد جامد کننده مانند آگار یا ژلاتین ندارند و رشد زیادی از کلنی های باکتری در محیط مشاهده می شود. محیط‌های مایع را آبگوشت نیز می‌نامند، هنگامی که در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت انکوبه می‌شوند، امکان رشد یکنواخت و کدر گونه‌های باکتریایی را فراهم می‌کنند. این محیطها برای رشد فراوان میکروارگانیسم ها و مطالعات تخمیر استفاده می شود. نمونه‌ها عبارتند از براث سویا Tryptic، براث کربوهیدرات قرمز فنل، براث MR-VP و براث مواد مغذی.

به غیر از اینها، محیط های دو فازی نیز وجود دارند که از هر دو محیط جامد و مایع تشکیل شده اند. و گاهی به جای آگار، زرده و سرم تخم مرغ را به عنوان ماده جامد کننده به محیط اضافه می کنند. در اینجا با نحوه ساخت صفحات آگار بیشتر آشنا شوید. این مواد در حالی که به طور طبیعی مایع هستند، با استفاده از گرما جامد می شوند و محیط تهیه شده با استفاده از تکنیک های خاصی استریل می شود.

ب- طبقه بندی بر اساس جزء تغذیه ای

1. محیط ساده: این یک محیط همه منظوره است که از رشد میکروب‌های غیرمجاز پشتیبانی می‌کند و در درجه اول برای جداسازی میکروارگانیسم ‌ها استفاده می‌شود. به عنوان مثال می توان از آبگوشت مغذی، پپتون واتر و نوترینت آگار نام برد.
2. محیط های پیچیده: محیط های حاوی مواد مغذی در مقادیر ناشناخته هستند که برای ایجاد یک ویژگی خاص از یک سویه میکروبی اضافه می شوند. به عنوان مثال می توان به براث سویا تریپتیک، آگار خون و براث مواد مغذی اشاره کرد.
3. محیط های مصنوعی: محیط های مصنوعی نوعی محیط های شیمیایی تعریف شده است و از مواد شیمیایی خالص تولید می شود. محیط تعریف شده به محیطی اطلاق می شود که غلظت مشخصی از مواد مانند قند (گلوکز یا گلیسرول) و منبع نیتروژن (مانند نمک آمونیوم یا نیترات به عنوان نیتروژن معدنی) داشته باشد. به طور کلی در تحقیقات علمی مورد استفاده قرار می گیرد و نمونه آن Czapek Dox Medium است.

ج. طبقه بندی محیط های کشت بر اساس کاربرد/ترکیب شیمیایی

1. محیط های پایه: این ها به طور معمول محیط های ساده و دارای منابع کربن و نیتروژن هستند که رشد بسیاری از میکروارگانیسم ها را تقویت می کنند. آنها همچنین به عنوان محیط های همه منظوره و غیرانتخابی محسوب می شوند. محیط های پایه برای رشد باکتری های غیر مستعد نیاز به منابع غنی ندارند و برای رشد استافیلوکوک و انتروباکتریاسه مناسب هستند. آنها معمولاً برای جداسازی میکروارگانیسم  ها در آزمایشگاه ها یا در فرآیندهای کشت فرعی استفاده می شوند. به عنوان مثال می توان به آبگوشت مغذی، نوترینت آگار و آب پپتون اشاره کرد.
2. محیط غنی شده: این محیط با افزودن مواد اضافی مانند خون، سرم یا زرده تخم مرغ در محیط پایه تهیه می شود. برای رشد میکروارگانیسم ‌های سخت‌گیر استفاده می‌شود، زیرا به مواد مغذی اضافی و مواد محرک رشد نیاز دارند. به عنوان مثال می توان به آگار شکلاتی، آگار خون و شیب سرم لوفلر اشاره کرد. از محیط شکلاتی برای رشد gonorrhea استفاده می شود در حالی که از بلاد آگار (که با افزودن 5-10 درصد خون حجمی به پایه خون آگار تهیه می شود) برای شناسایی باکتری های همولیتیک استفاده می شود.
3. محیط های انتخابی: این محیط رشد میکروب های خاصی را امکان پذیر می کند و در عین حال از رشد میکروب های دیگر جلوگیری می کند. این یک محیط مبتنی بر آگار است که برای جداسازی میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه استفاده می شود. رشد انتخابی میکروب ها با افزودن موادی مانند آنتی بیوتیک ها، رنگ ها، نمک های صفراوی یا با تنظیم pH تعیین می شود.

در زیر فهرستی از محیط‌های انتخابی رایج و باکتری‌هایی که برای کشت استفاده می‌شوند آورده شده است:

	محیط کشت	مهار کننده	باکتری هدف
1	Thayer Martin Agar	حاوی آنتی بیوتیک؛ وانکومایسین، کولیستین و نیستاتین	Neisseria gonorrhoeae
2	MacConkey’s Agar	حاوی نمک های صفراوی	Enterobacteriaceae members
3	Lowenstein Jensen Medium	افزودن مالاشیت سبز	M.tuberculosis
4	Mannitol Salt Agar	حاوی 10٪ NaCl	S.aureus
5	Crystal Violet Blood Agar	حاوی 0.0002% کریستال ویولت	Streptococcus pyogenes
6	Thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS) agar	دارای pH بالا در حدود 8.5-8.6	Vibrio cholerae
7	Wilson and Blair’s Agar	افزودن رنگ سبز درخشان	S. typhi
8	Potassium tellurite medium	حاوی 0.04% تلوریت پتاسیم است	C.diphtheriae
9	Pseudosel Agar (cetrimide agar)	حاوی ستریماید (عامل ضد عفونی کننده)	Pseudomonas aeruginosa
10	Salmonella-Shigella Agar	حاوی نمک های صفراوی، سبز درخشان و سیترات سدیم است	Salmonella

4.محیط غنی کننده: یک محیط مایع است که برای افزایش غلظت نسبی باکتری‌های خاص قبل از کشت روی یک صفحه محیط جامد استفاده می‌شود. این محیط به عنوان یک محیط آبگوشت استفاده می شود و از رشد گونه های مشترک میکروارگانیسم  ها (آنهایی که در ارتباط نزدیک با یکدیگر زندگی می کنند) در نمونه بالینی جلوگیری می کند. همچنین در جداسازی میکروارگانیسم  های مدفوع و خاک استفاده می شود. از جمله انواع این محیط عبارتند از براث سلنیت F که برای جداسازی سالمونلا تیفی از نمونه مدفوع، براث تتراتیونات و آب پپتون قلیایی استفاده می‌شود.

5.محیط های افتراقی یا شاخص: حاوی شاخص های خاصی مانند رنگ ها یا سوبستراهای متابولیکی در ترکیب محیط است که به کلنی های گونه های میکروبی مختلف در هنگام استفاده یا واکنش با این اجزا رنگ های متفاوتی می دهد. این محیط اجازه می دهد تا بیش از یک میکروارگانیسم رشد کند، با این حال، کلنی های باکتری بر اساس رنگ آنها متمایز می شوند، زمانی که یک تغییر شیمیایی در نشانگر رخ می دهد، مانند قرمز خنثی، قرمز فنل، آبی متیلن. انواع این محیط عبارتند از:

آگار خون(Blood Agar): در آگار خون سه نوع لیز یا همولیز سلول های خونی مشاهده می شود: همولیز آلفا، بتا و گاما. این محیط  اجازه می دهد تا بسیاری از میکروارگانیسم  ها رشد کنند، با این حال، توانایی آنها در لیز سلول های خونی متفاوت است، که ایت اتفاق به تشخیص کلونی های باکتری کمک می کند. به عنوان مثال، استافیلوکوکوس پیوژنز به طور کامل سلول های خونی را لیز می کند (بتا همولیز) و در نتیجه باعث پاکسازی کامل محیط اطراف کلنی های آن می شود. استافیلوکوکوس پنومونیه تا حدی گلبول‌های قرمز را لیز می‌کند و در نتیجه محیطی سبز رنگ ایجاد می‌کند، در حالی که میکروارگانیسم ‌های همولیتیک گاما مانند انتروکوکوس فکالیس، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس نمی‌توانند گلبول‌های قرمز را لیز کنند و در نتیجه تغییر رنگی در محیط ایجاد نمی‌کنند.

Mannitol Salt Agar: تخمیر مانیتول توسط استافیلوکوکوس اورئوس باعث می شود که محیط به رنگ زرد تغییر کند، اما استافیلوکوک های کواگولاز منفی که نمی توانند باعث تخمیر شوند به رنگ صورتی ظاهر می شوند.

MacConkey آگار: باکتری های گرم منفی را بر اساس توان متابولیسم لاکتوز آنها متمایز می کند. باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز مانند اشریشیا کلی، کلبسیلا، سیتروباکتر و انتروباکتر کلنی‌های قرمز مایل به قرمز را تشکیل می‌دهند، در حالی که غیر تخمیرکننده‌های لاکتوز مانند سالمونلا، شیگلا، پروتئوس، پروویدنسیا، سودوموناس و مورگانلا کلنی‌های کم رنگ یا بی‌رنگ را تشکیل می‌دهند.

تیوسولفات سیترات نمک های صفراوی ساکارز (TCBS) آگار: محیط حاوی ساکارز است که توسط میکروب های تخمیر کننده استفاده می شود و به تمایز آنها از میکروارگانیسم  های تخمیر نکننده کمک می کند. بر اساس این ویژگی، کلنی های باکتریایی رنگی متفاوتی روی محیط تشکیل می دهند که به شناسایی و تمایز آنها از یکدیگر کمک می کند. به عنوان مثال، V. cholerae ساکارز را تخمیر می کند و کلنی های زرد کمی مسطح با مراکز مات و حاشیه های شفاف تشکیل می دهد. در حالی که V. parahaemolyticus نمی تواند ساکارز را تخمیر کند و کلنی های سبز تا آبی-سبز را تشکیل می دهد.

6. محیط های انتقال: محیط های حمل و نقل برای نمونه های بالینی مفید هستند که باید فوراً به آزمایشگاه منتقل شوند تا زنده ماندن پاتوژن های بالقوه حفظ شود و از رشد بیش از حد عناصر مشترک یا میکروارگانیسم های آلوده جلوگیری شود. برخی از آنها از نظر قوام نیمه جامد هستند و نمونه هایی از آنها عبارتند از:

گلیسرول سالین بافر ساچ: برای انتقال مدفوع بیماران مشکوک به اسهال خونی باسیلی استفاده می شود.

انتقال کری بلر و محیط ونکاترامان راماکریشنان: نمونه های مدفوع جمع آوری شده از بیماران مشکوک به وبا با استفاده از این محیط ها منتقل می شوند.

7. محیط Pike: یک نمونه گلو حاوی استرپتوکوک با استفاده از این محیط منتقل می شود.
8. محیط های بی هوازی: این محیط برای کشت و نگهداری باکتری های بی هوازی است که به سطوح کم اکسیژن، مواد مغذی اضافی و پتانسیل کاهشی اکسیداسیون نیاز دارند. این محیط با مواد مغذی هیمین و ویتامین K تکمیل می شود و با جوشاندن آن در حمام آب و بستن آن با فیلم پارافین، اکسیژن از آن خارج می شود. نمونه های آن عبارتند از: براث تیوگلیکولات و محیط گوشت پخته شده رابرتسون (RCM) که معمولاً برای رشد گونه های کلستریدیوم استفاده می شود.
9. محیط سنجش: برای سنجش اسیدهای آمینه، ویتامین ها و آنتی بیوتیک ها استفاده می شود. به عنوان مثال، از محیط های سنجش آنتی بیوتیک برای تعیین قدرت آنتی بیوتیکی میکروارگانیسم ها استفاده می شود.
10. محیط ذخیره سازی: برای نگهداری میکروارگانیسم ها برای مدت طولانی تری استفاده می شود، نمونه هایی از آن عبارتند از آب گوشت پخته شده با گچ و محیط نمک تخم مرغ.
    • جمع بندی

محیط کشت منبع مواد مغذی و فاکتورهای رشد مورد نیاز برای رشد میکروارگانیسم  ها و حتی گیاهان در شرایط آزمایشگاهی است. هر موجودی بر اساس زیستگاه یا شرایط زندگی، نیازهای تغذیه ای متفاوتی دارد. بنابراین، یک فرمول واحد از محیط کشت نمی تواند برای رشد همه موجودات در آزمایشگاه استفاده شود. بسیاری از انواع محیط های کشت توسط دانشمندان برای رشد میکروارگانیسم  های انتخابی یا دلخواه ساخته شده اند. که بر اساس ترکیب مواد مغذی، قوام و کاربرد یا استفاده در آزمایشگاه‌های علوم زیستی طبقه‌بندی می‌شوند. محیط‌های کشت در آزمایشگاه‌ها اهداف مختلفی مانند جداسازی سویه‌های خاص از میکروارگانیسم ‌ها، شناسایی پاتوژن‌های بیماری‌زا، تهیه کشت خالص گونه‌های میکروبی، تشخیص گونه‌های باکتریایی و مطالعه پاسخ آنها به آنتی‌بیوتیک‌های خاص را انجام می‌دهند. بنابراین، قبل از تصمیم گیری در مورد استفاده از محیط کشت، تعیین هدف مطالعه و در برخی موارد نوع میکروارگانیسم ی که می خواهید مطالعه کنید بسیار مهم است.

لیستی از مهمترین محیط کشت های میکروبی ( بیوتکنولوژی) را در ادامه مشاهده می کنید

1. A7 and A8 agars
2. Alkaline peptone water
3. American Trudeau Society medium
4. Amies transport medium with and without charcoal
5. Anaerobic blood agar
6. 10B arginine broth; Shepard’s broth
7. Ashdown agar
8. Azide Dextrose Broth, Rothe’s broth
9. Bacillus cereus medium
10. BACTEC 12B radiometric medium
11. Bacteroides bile esculin agar
12. Baird-Parker agar base
13. Barbour-Stoenner-Kelly medium
14. BEA agar Bile Aesculin Agar, BEA Agar
15. Bromocresol purple lactose agar, BCP Agar
16. Bile esculin agar
17. Bile esculin agar plus vancomycin at 6 μg/ml
18. Bile esculin azide agar and broth (Enterococcosel)
19. Bismuth sulfite agar
20. Blood agar
21. Blood culture media
22. Bordet-Gengou medium
23. Brain heart infusion agar
24. Brain heart infusion agar with 7% horse blood and brain heart infusion agar with 1% serum
25. Brain heart infusion broth
26. Brain heart infusion-vancomycin agar
27. Brilliant green agar
28. Brucella agar
29. Brucella agar with cefoxitin and cycloserine
30. Brucella agar with hemin and vitamin K
31. Brucella agar with 5% horse blood
32. Brucella broth
33. Buffered charcoal yeast extract (BCYE)
34. Buffered glycerol saline
35. Burkholderia cepacia selective agar
36. Campylobacter blood agar
37. Campylobacter charcoal differential (CCD) agar
38. Campylobacter thioglycolate medium
39. Cary-Blair transport medium
40. Cefoperazone-vancomycin-amphotericin B (CVA) medium
41. Cefsulodin-Irgasan-novobiocin (CIN) medium (Yersinia selective agar)
42. Cetrimide agar
43. Charcoal selective medium
44. Chocolate agar
45. Chopped meat glucose broth
46. CHROMagar (Rambach agar)
47. Columbia agar with 5% sheep blood
48. Columbia broth
49. Columbia-colistin-nalidixic acid agar with 5% sheep blood
50. Cycloserine-cefoxitin-fructose agar
51. Cysteine-albumin broth with 20% glycerol
52. Cystine glucose blood agar
53. Cystine-tellurite blood agar
54. Cystine tryptic agar
55. Diagnostic sensitivity agar
56. DNA-toluidine blue agar
57. DNAse test agar Deoxyribonuclease (DNase)
58. Dubos Tween-albumin broth
59. Egg yolk agar (modified McClung-Toabe agar)
60. Ellinghausen-McCullough/Johnson-Harris medium
61. Enterococcosel agar
62. Eosin-methylene blue (EMB) agar Eosin Methylene Blue Agar (EMB)
63. ESP Culture System II
64. Egg-tellurite-glycine-pyruvate-agar (ETGPA)
65. Fastidious anaerobic agar (Fusobacterium selective agar)
66. Fletcher’s medium
67. FlexTrans viral and chlamydia transport medium
68. GC agar base
69. GN broth
70. Haemophilus test medium (HTM) and broth
71. Heart infusion agar and broth
72. Hektoen enteric agar
73. Hemin-supplemented egg yolk agar
74. Hugh Leifson medium (M.E.V.A.G)
75. Isolator or lysis-centrifugation tube (Wampole Laboratories)
76. Iso-Sensitest agar and broth
77. John E. Martin Biological Enrichment Chamber (JEMBEC) (BBL) and InTray GC System transport medium
78. Kanamycin-vancomycin laked sheep blood agar
79. Lactobacillus MRS broth
80. LB broth also known as LB Medium, Lysogenia Broth, Luria Broth or Luria-Bertani medium,
81. Levinthal agar with bacitracin and influenzae antiserum
82. Lim broth
83. Lithium chloride-phenylethanolmoxalactam agar
84. Loeffler’s medium
85. Lombard-Dowell egg yolk agar
86. Lowenstein-Jensen medium
87. Lowenstein-Jensen medium (Gruft modification)
88. Lowenstein-Jensen medium (Mycobactosel modification)
89. Lowenstein-Jensen medium with 1% ferric ammonium citrate
90. Lowenstein-Jensen medium with 5% NaCl
91. Lysis-centrifugation tube
92. MacConkey agar
93. MacConkey agar with sorbitol (SMAC)
94. MacConkey broth
95. Mannitol-egg yolk-polymyxin B agar
96. Mannitol salt agar Chapman Agar or Mannitol Salt Agar
97. Martin-Lewis agar
98. MB/BacT ALERT (bioMèrieux)
99. MGIT (mycobacteria growth indicator tube)
100. Middlebrook 7H10 agar
101. Middlebrook 7H11 agar
102. Middlebrook 7H9 broth with glycerol
103. Mitchison 7H11 selective agar
104. Modified Irgasan-ticarcillin-potassium chromate broth
105. Modified Thayer-Martin agar
106. Mueller-Hinton agar with and without 5% sheep blood
107. Mueller-Hinton agar with 2% NaCl
108. Mueller-Hinton agar with 4% NaCl and 6 gm of oxacillin per ml
109. Mueller-Hinton broth
110. Multiprobe media (M4-3, M5, and M4-RT)
111. MRS agar (from De Man, Rogosa and Sharpe)
112. Mycobactosel agar
113. MycoTrim GU and MycoTrim RS
114. NAG medium
115. Neomycin egg yolk agar
116. Neomycin-vancomycin agar
117. New York City medium
118. Nucleic acid transport (NAT)
119. Nutrient agar
120. Nutrient broth
121. Oxford agar
122. Oxidative-fermentative polymyxin B-bacitracinlactose agar
123. P agar
124. PALCAM Listeria Agar
125. PCA agar (Plate Count Agar)
126. Peptone yeast extract broth
127. Petragnani medium
128. Phenylethyl alcohol agar
129. PLM-5 TM
130. Polymyxin B-acriflavine-lithium chlorideceftazidime-esculin-mannitol (PALCAM) agar
131. Polymyxin B-lysozyme-EDTA-thallous acetate agar
132. Polymyxin B-pyruvate-egg yolk-mannitolbromthymol blue agar
133. Polysorbate 80 medium
134. PRAS media
135. Pseudomonas cepacia (PC) agar
136. Rambach agar
137. Rappaport-Vassiliadis enrichment broth
138. Regan-Lowe medium
139. Salmonella-shigella agar
140. Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
141. Schaedler’s agar
142. Schleifer-Kramer agar
143. Selenite broth
144. Sensitest agar
145. Septic-Chek biphasic mycobacterial media
146. Simmons Citrate Agar
147. Salmonella Shigella Agar | SS agar
148. Skirrow medium
149. STGG
150. StrepB carrot broth kit (Hardy Diagnostics) and GBS broth (Northeast Laboratory Services)
151. Streptococcus selective agar
152. Stuart’s transport media with and without charcoal
153. Sucrose-phosphate-glutamate transport medium
154. 2-Sucrose-phosphate transport media
155. Tetrathionate broth base
156. Thayer-Martin agar
157. Thioglycolate with hemin and vitamin K
158. Thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS)
159. Thioglycolate broth
160. Tinsdale agar
161. Todd-Hewitt broth with gentamicin and nalidixic acid
162. Tryptic or Trypticase soy agar base with 5% sheep blood
163. Tryptic or Trypticase soy broth
164. Trypticase soy agar with horse or rabbit blood
165. Trypticase Soy Agar Tryptone Soy Agar, Tryptone Soy Agar (TSA), or (TSB), called Soybean-Casein Digest Agar
166. Triple Sugar Iron agar
167. University of Vermont modified listeria enrichment broth
168. V agar
169. VMGA III medium
170. VRBL agar
171. Wadowsky-Yee medium
172. Wilkins-Chalgren broth and agar
173. Xylose-lysine-desoxycholate (XLD) agar XLD Agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar)
174. Yersinia selective agar
175. YEPD agar – YPD Agar (YPD or YEPD) and YPD Broth

به منظور خرید محیط کشت های میکروبی بر روی این قسمت کلیک کنید

جهت درخواست هرگونه مشاوره و راهنمایی با کارشناسان شرکت کیاژن فناور تماس حاصل بفرمایید.

محیط کشت سلول های جانوری

کشت سلول جانوری به شرایط محیطی خاصی نیاز دارد. برای رشد و تکثیر مطلوب، سلول ها نیاز به:

• کنترل دما
• pH و اسمولالیته مناسب
• بستری برای اتصال سلولی
• نوع خاصی از محیط کشت
• انکوباتور برای حفظ شرایط پایدار

نیاز دارند.

محیط کشت سلولی یکی از مهمترین مؤلفه های حیاتی رشد سلول می باشد و ما توضیح خواهیم داد که محیط کشت سلولی و اجزای آن چیست، انواع مختلف آن چیست و هنگام انتخاب یک محیط کشت سلولی مناسب به چه نکاتی توجه کنیم.

محیط کشت سلولی چیست؟

محیط کشت سلولی که به عنوان محیط رشد نیز شناخته می شود، به اصطلاح یک چتر بوده که شامل ژل یا مایعی است که برای حمایت از رشد سلولی در یک محیط مصنوعی ایجاد می شود. وقتی دانشمندان سلول‌ها، اندام‌ها یا بافت‌های موجودات زنده را جدا می‌کنند، باید آنها را در یک محیط مصنوعی مناسب نگهداری کنند. یک محیط کشت نقش اساسی در فناوری کشت سلولی ایفا می کند و از تحقیقات سلولی در شرایط آزمایشگاهی پشتیبانی می کند. این محیطی مواد مغذی لازم برای زنده ماندن و تکثیر کشت های سلولی را تامین می کند. محیط رشد همچنین اسمولالیته و pH صحیح را فراهم می کند. دانشمندان هنگام انتخاب محیط رشد مناسب باید نوع سلول خود را در نظر بگیرند. انواع مختلفی از محیط های کشت سلولی وجود دارد که سلول های پستانداران، گیاهان، حشرات، باکتری ها، مخمرها، ویروس ها و غیره را در خود جای می دهند.

انتخاب محیط کشت سلولی مستقیماً بر نتایج آزمایش تأثیر می‌گذارد و به همین دلیل باید به دقت مورد توجه قرار گیرد.

مواد تشکیل دهنده محیط کشت سلولی چیست؟

محیط کشت سلولی شامل مخلوطی از ترکیبات و مواد مغذی است که برای حمایت از رشد سلولی طراحی شده اند. اجزای متداول محیط کشت سلولی عبارتند از:

• اسیدهای آمینه: هر محیط کشت سلولی حاوی مخلوطی از اسیدهای آمینه بعنوان بلوک های سازنده پروتئین است. هر دو گروه آمینو اسید ضروری و غیر ضروری ممکن است برای تقویت زنده ماندن و رشد سلول استفاده شوند.
• ویتامین ها: ویتامین ها برای تسهیل رشد و تکثیر سلولی گنجانده شده اند. سرم به عنوان منبع بسیاری از ویتامین ها در محیط های حاوی سرم استفاده می شود، اما ویتامین ها باید به محیط های بدون سرم اضافه شوند.
• کربوهیدرات ها: کربوهیدرات ها منبع انرژی برای سلول های زنده هستند که گلوکز معمولا استفاده می شود، اما کربوهیدرات های دیگری مانند گالاکتوز، فروکتوز یا مالتوز نیز در دسترس هستند.
• نمک های غیر آلی: نمک های معدنی برای تنظیم پتانسیل غشا و اسمولالیته مورد نیاز هستند.
• عناصر اساسی و کمیاب: سلول ها برای رشد به عناصری مانند آهن، پتاسیم، منیزیم و روی نیاز دارند.
• سرم: سرم حاوی فاکتورها و مهارکننده های رشد، هورمون ها، مهارکننده های پروتئاز، شلاتورها، اسیدهای آمینه، کربوهیدرات ها، لیپیدها، ویتامین ها، عناصر کمیاب، مواد معدنی و غیره است که برای رشد سلولی مورد نیاز است. سرم گاوی معمولا استفاده می شود.
• هورمون ها: هورمون های خاصی ممکن است برای تأثیرگذاری بر عملکرد سلولی، رشد و تکثیر اضافه شوند.
• سیستم های بافر: سیستم های بافر pH را تنظیم می کنند.
• مکمل‌ها: مکمل‌هایی مانند هورمون‌ها، مهارکننده‌های آنزیم و عناصر کمیاب گاهی به محیط‌های کشت سلولی اضافه می‌شوند که نوع سلول و هدف تحقیق را برآورده می‌کنند.
• آنتی بیوتیک ها: آنتی بیوتیک ها به محیط های کشت سلولی اضافه می شوند تا از رشد قارچ ها و باکتری ها جلوگیری کنند. آنتی بیوتیک ها به لطف پروتئین هایی که مقداری از بار آنتی بیوتیکی را به هم متصل می کنند، برای محیط های سرمی مناسب تر هستند. در مقابل، سلول‌های موجود در محیط‌های بدون سرم در معرض خطر بیشتری برای سمیت آنتی‌بیوتیکی قرار دارند.

انواع مختلف محیط های کشت سلولی کدامند؟

محیط های کشت سلولی را می توان به دو دسته اصلی تقسیم کرد: محیط های طبیعی و محیط های مصنوعی.

2-3-1- محیط های طبیعی

محیط های طبیعی آنهایی هستند که از استخراج بافت یا مایعات بدن حیوانات مانند پلاسما، لنف و سرم به دست می آیند. محیط های طبیعی را می توان به سه گروه تقسیم کرد:

• مایعات بیولوژیکی: به عنوان مثال می توان به سرم، پلاسما، لنف و مایع آمنیوتیک اشاره کرد.
• عصاره های بافتی: به عنوان مثال می توان به عصاره جنین، مغز استخوان، تومور و کبد اشاره کرد.
• لخته ها یا منعقد کننده ها: به عنوان مثال می توان به لخته های پلاسما و مواد منعقد کننده اشاره کرد.

سرم رایج ترین محیط طبیعی است. سرم حتی به عنوان مکمل در کشت های محیط مصنوعی استفاده می شود. سرم گاوی به دلیل مزایای متعدد، از جمله منابع فراوان و زمان استفاده طولانی، محبوب است.

2-3-2- محیط های مصنوعی

محیط های مصنوعی آنهایی هستند که با استفاده از انواع ترکیبات آلی و معدنی ایجاد می شوند. محیط های مصنوعی عبارتند از:

• محیط های حاوی سرم: محیط های مصنوعی که در آن از سرم مکمل استفاده می شود.
• محیط‌های بدون سرم: محیط‌های بدون سرم (SFM) قوام بیشتری نسبت به محیط‌های حاوی سرم ارائه می‌دهند و به محققان اجازه می‌دهند از رشد و تکثیر سلولی بدون نیاز به سرم حمایت کنند.
• محیط های شیمیایی تعریف شده: محیط های شیمیایی تعریف شده بدون آلودگی هستند و فقط از اجزای آلی و معدنی خالص شده تشکیل شده اند.
• محیط های بدون پروتئین: محیط های بدون پروتئین حاوی پروتئین نیستند. مکمل های پروتئینی بر اساس نیاز اضافه می شوند.
• محلول های نمک متعادل(BSS): BSS به تنهایی برای زنده نگه داشتن سلول ها استفاده می شود. BSS با مواد مغذی و سایر ترکیبات غنی شده است تا محیط کشت را ایجاد کند که قادر به حمایت از رشد و تکثیر سلولی باشد. به این ترتیب، BSS پایه و اساس بسیاری از انواع محیط های پیچیده را تشکیل می دهد.

محیط های بدون سرم (SFM) اغلب به عنوان پایه / پایه یا پیچیده طبقه بندی می شوند. محیط های پایه آنهایی هستند که مکمل ندارند. هنگامی که مکمل های رشد به یک محیط پایه اضافه می شود، به یک محیط پیچیده تبدیل می شود.

لیست تعدادی از محیط کشت های سلولی در جدول زیر اماده است:

نام	نوع محیط	توضیح
MEM (Minimum Essential Medium)	محیط کشت پایه	این محیط که به عنوان محیط حداقل ضروری Eagle (EMEM) نیز شناخته می شود، برای کشت های اولیه و دیپلوئید استفاده می شود. MEM ها فقط حاوی ویتامین ها، اسیدهای آمینه غیر ضروری، نمک های معدنی و گلوتامین هستند.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	محیط کشت پایه	مشابه MEM، اما با اسیدهای آمینه و ویتامین های اضافی و فاقد محرک رشد یا پروتئین است.
IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)	محیط کشت پیچیده	نسخه اصلاح شده DMEM با اسیدهای آمینه و ویتامین های بیشتر. آهن ندارد اما سلنیوم و نیترات آهن دارد. مناسب برای کشت های با تراکم بالا.
RPMI-1640	محیط کشت پیچیده	محیطی که برای اکثر انواع سلول های پستانداران کار می کند. یکی از پرکاربردترین محیط های کشت است.
Ham’s F-10 and F-12	محیط کشت بدون سرم	Ham’s F-10 مخلوط اصلی مواد مغذی Ham می باشد که برای استفاده با سلول های تخمدان همستر چینی (CHO) طراحی شده است. برای استفاده با سلول های دیپلوئید انسانی مناسب است. Ham’s F-12 پیچیده‌تر بوده و برای سلول‌های اپیتلیال پروستات و سلول‌های کبدی موش مناسب است.

به منظور انتخاب محیط کشت سلولی چه چیزی را باید جستجو کرد

در مرحله اول با تحقیق در مورد رده سلولی که استفاده می کنید و با تعیین اینکه چه محیط های کشت مختلفی توصیه می شود، شروع کنید. سپس می توانید چند مورد را انتخاب کنید و آنها را امتحان کنید تا ببینید کدام محیط برای سلول شما بهترین کارایی را دارد. در ادامه چند فاکتور مهم را مطرح میکنیم که باید در نظر بگیرید.

2-4-1- آماده سازی محیط

انواع محیط کشت سلولی به سه شکل وجود دارد:

1. محیط پودری: محیط های پودری کم هزینه ترین هستند اما باید توسط محقق استریل و تهیه شوند.
2. محیط غلیظ: محیط غلیظ فقط باید توسط محقق رقیق شود.
3. محیط محلول آماده به کار: این نوع محیط ها ساده ترین نوع محیط هستند. آنها طوری طراحی شده اند که بدون هیچ گونه دستکاری توسط محقق مورد استفاده قرار گیرند.

2-4-2-. نوع محیط مورد استفاده: محیط های طبیعی در مقابل مصنوعی

همانطور که ذکر شد، همه محیط های کشت سلولی به یکی از این دو دسته تعلق دارند: محیط های طبیعی یا محیط های مصنوعی. هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارند که بر اساس آن محققان تصمیم می گیرند که کدام محیط را انتخاب کنند.

محیط سرمی با حذف هملوسین از پلاسما ایجاد می شود. مخلوط حاصل حاوی ترکیبی از اجزای است که برای رشد و تکثیر سلولی ارزشمند می باشند. مزایای محیط کشت سرم عبارتند از:

• از طیف گسترده ای از مواد مغذی سلولی مانند اسیدهای آمینه، ویتامین ها، مواد معدنی و اسیدهای چرب تشکیل شده است.
• اجزایی را فراهم کنید که امکان چسبندگی سلول را فراهم کند.
• حاوی انواع فاکتورهای رشد و هورمون ها باشد.

اما محیط های سرم دارای نکات منفی هستند:

• عدم یکنواختی ترکیب، که آن را برای آزمایش‌های مقیاس بزرگ مناسب نمی‌کند.
• حاوی مخلوطی از ترکیبات است که برخی از آنها می توانند برای انواع خاصی از سلول ها مضر باشند یا از رشد آنها جلوگیری کنند.
• در مقایسه با محیط های مصنوعی، خطر آلودگی بیشتری دارند.
• ممکن است جداسازی محصولات کشت سلولی را پیچیده کند.
• می تواند گران باشد.

محیط های مصنوعی مزیت متمایز سازگاری را دارند که محققین می توانند در استفاده از این نوع محیط ها حتی زمانی که تحقیقات در مقیاس بالا انجام می شوند مطمئن باشند که از محیط کشت یکنواخت استفاده می کنند، علاوه بر این، محیط های مصنوعی معمولاً ارزان تر از محیط های مبتنی بر سرم هستند.

با این حال، استفاده از یک محیط بدون سرم دارای معایبی است. این کشت ها به موارد افراطی از جمله دما، pH و اسمولالیته حساس تر هستند.

2-4-3- از کدام محیط خاص استفاده کنید

هنگامی که بین محیط های طبیعی و مصنوعی انتخاب کردید، باید یک محیط خاص را انتخاب کنید. بسیاری از آزمایشگاه‌ها از محیط‌های تجاری استفاده می‌کنند که کیفیت و ثبات را با حداقل تلاش ممکن می‌سازد.

برای پیدا کردن بهترین، باید از خود بپرسید:

• از چه نوع سلول هایی استفاده خواهید کرد و نیازهای آنها چیست؟
• قابلیت ها و محدودیت های آزمایشگاه شما چیست؟
• هدف از آزمایش چیست؟

به عنوان مثال، سلول های بنیادی به محیطی نیاز دارند که بتواند نگهداری، تمایز، گسترش و کاربردهای پایین دستی را تسهیل کند. از آنجایی که سلول‌های بنیادی پرتوان هستند، شرایط محیطی آن‌ها باید به دقت بررسی شود تا محققان به چیزی غیر از هدفشان نرسند. محیط های تجاری خاصی برای استفاده سلول های بنیادی طراحی شده اند، مانند RPMI-1640 که به خوبی با انواع خاصی از سلول های بنیادی کار می کنند.

در ادامه لیستی از محیط های کشت پر کاربرد در کشت سلول جانوران درج شده است:

Cell Line	Cell Type	Species	Tissue	Medium*
293	fibroblast	human	embryonic kidney	MEM and 10% FBS
3T6	fibroblast	mouse	embryo	DMEM and 10% FBS
A549	epithelial	human	lung carcinoma	F-12K and 10% FBS
A9	fibroblast	mouse	connective tissue	DMEM and 10% FBS
AtT-20	epithelial	mouse	pituitary tumor	F-10, 15% horse serum and 2.5% FBS
BALB/3T3	fibroblast	mouse	embryo	DMEM and 10% FBS
BHK-21	fibroblast	hamster	kidney	GMEM and 10% FBS or MEM and 10% FBS plus NEAA
BHL-100	epithelial	human	breast	McCoy’s 5A and 10% FBS
BT	fibroblast	bovine	turbinate cells	MEM and 10% FBS plus NEAA
Caco-2	epithelial	human	colon adeno carcinoma	MEM and 20% FBS plus NEAA
Chang	epithelial	human	liver	BME and 10% calf serum
CHO-K1	epithelial	hamster	ovary	F-12 and 10% FBS
Clone 9	epithelial	rat	liver	F-12K and 10% FBS
Clone M-3	epithelial	mouse	melanoma	F-10, 15% horse serum and 2.5% FBS
COS-1, COS-3, COS-7	fibroblast	monkey	kidney	DMEM and 10% FBS
CRFK	epithelial	cat	kidney	MEM and 10% FBS plus NEAA
CV-1	fibroblast	monkey	kidney	MEM and 10% FBS
D-17	epithelial	dog	osteosarcoma	MEM and 10% FBS and NEAA
Daudi	lymphoblast	human	blood from a lymphoma patient	RPMI-1640 and 10% FBS
GH1, GH3	epithelial	rat	pituitary tumor	F-10, 15% horse serum and 2.5% FBS
H9	lymphoblast	human	T-cell lymphoma	RPMI-1640 and 20% FBS
HaK	epithelial	hamster	kidney	BME and 10% calf serum
HCT-15	epithelial	human	colorectal adenocarcinoma	RPMI-1640 and 10% FBS
HeLa	epithelial	human	cervix carcinoma	MEM and 10% FBS plus NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2	epithelial	human	larynx carcinoma	MEM and 10% FBS
HL-60	lymphoblast	human	promyelocytic leukemia	RPMI-1640 and 20% FBS
HT-1080	epithelial	human	fibrosarcoma	MEM and 10% HI FBS plus NEAA
HT-29	epithelial	human	colon adenocarcinoma	McCoy’s 5A and 10% FBS
HUVEC	endothelial	human	umbilical cord	F-12K and 10% FBS plus 100 µg/ml heparin
I-10	epithelial	mouse	testicular tumor	F-10, 15% horse serum and 2.5% FBS
IM-9	lymphoblast	human	marrow from myeloma patient	RPMI-1640 and 10% FBS
JEG-2	epithelial	human	choriocarcinoma	MEM and 10% FBS
Jensen	fibroblast	rat	sarcoma	McCoy’s 5A and 5% FBS
Jurkat	lymphoblast	human	lymphoma	RPMI-1640 and 10% FBS
K-562	lymphoblast	human	myelogenous leukemia	RPMI-1640 and 10% FBS
KB	epithelial	human	oral carcinoma	MEM and 10% FBS plus NEAA
KG-1	myeloblast	human	marrow from erythroleukemia patient	IMDM and 20% FBS
L2	epithelial	rat	lung	F-12K and 10% FBS
LLC-WRC 256	epithelial	rat	carcinoma	Medium 199 and 5% horse serum
McCoy	fibroblast	mouse	unknown	MEM and 10% FBS
MCF7	epithelial	human	breast adenocarcinoma	MEM and 10% FBS plus NEAA and 10 µg/ml insulin
WI-38	epithelial	human	embryonic lung	BME and 10% FBS
WISH	epithelial	human	amnion	BME and 10% FBS
XC	epithelial	rat	sarcoma	MEM and 10% FBS plus NEAA
Y-1	epithelial	mouse	tumor of adrenal	F-10, 15% horse serum and 2.5% FBS

به منظور خرید محیط کشت های جانوری بر روی این قسمت کلیک کنید

جهت درخواست هرگونه مشاوره و راهنمایی با کارشناسان شرکت کیاژن فناور تماس حاصل بفرمایید.

محیط کشت گیاهی

-1- مقدمه

رشد بهینه و مورفوژنز بافت ها ممکن است برای گیاهان مختلف با توجه به نیازهای غذایی آنها متفاوت باشد. علاوه بر این، بافت‌های قسمت‌های مختلف گیاهان نیز ممکن است نیازهای متفاوتی برای رشد رضایت‌بخش داشته باشند. محیط های کشت بافت ابتدا از محلول های مغذی مورد استفاده برای کشت گیاهان کامل ساخته شدند.

3-1- ترکیب محیط

محیط کشت بافت گیاهی به طور کلی باید شامل برخی یا همه اجزای زیر باشد: درشت مغذی ها، ریز مغذی ها، ویتامین ها، اسیدهای آمینه یا مکمل های نیتروژن، منبع(های) کربن، مکمل های آلی تعریف نشده، تنظیم کننده های رشد و عوامل جامد کننده. طبق اعلام انجمن بین المللی فیزیولوژی گیاهی، عناصر در غلظت های بیشتر از 0.5 mM.l-1 به عنوان عناصر ماکرو و عناصر مورد نیاز در غلظت های کمتر از 0.5 mM.l-1 به عنوان ریزعناصر تعریف می شوند. باید در نظر داشت که غلظت بهینه هر ماده غذایی برای دستیابی به حداکثر نرخ رشد در بین گونه‌ها متفاوت است.

3-1-1- درشت مغذی ها

عناصر ضروری در محیط کشت سلولی یا بافتی گیاهی، علاوه بر C، H و O، عناصر درشت: نیتروژن (N)، فسفر (P)، پتاسیم (K)، کلسیم (Ca)، منیزیم (Mg) و گوگرد (S) هستند. برای رشد و ریخت زایی رضایت بخش محیط کشت باید حداقل 60-25 میلی مولار نیتروژن معدنی داشته باشد. پتاسیم برای رشد سلولی اکثر گونه های گیاهی مورد نیاز است. بیشتر محیط‌ها حاوی پتاسیم به شکل نمک‌های کلرید نیترات با غلظت‌های بین 20 تا 30 میلی‌مولار هستند. غلظت های بهینه فسفر، منیزیم، S و کلسیم از 1 تا 3 میلی مولار در صورت تامین سایر الزامات برای رشد سلولی متغیر است.

3-1-2- ریز مغذی ها

ریزمغذی های ضروری (عناصر فرعی) برای رشد سلول و بافت گیاهی عبارتند از آهن (Fe)، منگنز (Mn)، روی (Zn)، بور (B)، مس (Cu) و مولیبدن (Mo). آهن معمولاً از همه ریز مغذی ها مهم ترین است. این عنصر به عنوان نمک سیترات یا تارتارات در محیط های کشت استفاده می شود، با این حال، مشکلاتی در مورد این ترکیبات به دلیل دشواری حل شدن و رسوب آنها پس از آماده سازی محیط وجود دارد. آزمایشاتی برای حل این مشکل با استفاده از اتیلن دی آمین تتراستیک اسید (EDTA) – کلات آهن (FeEDTA) انجام شده  و روشی برای تهیه محلول کلات آهن که رسوب نمی کند نیز ایجاد شده است. کبالت (Co) و ید (I) ممکن است به محیط های خاصی اضافه شوند، اما نیاز آنها برای رشد سلولی به طور دقیق مشخص نشده است. سدیم (Na) و کلر (Cl) نیز در برخی محیط ها استفاده می شود، علی رغم گزارش هایی مبنی بر اینکه برای رشد ضروری نیستند. مس و کبالت در غلظت 0.1μM، آهن و مولیبدن در 1μM، ید در 5μM، روی در 5-30μM، منگنز در 20-90μM و بور در 25-100μM به محیط کشت اضافه می شوند.

3-1-3- کربن و منابع انرژی

در محیط های کشت سلولی گیاهی، علاوه بر ساکارز که اغلب به عنوان منبع کربن با غلظت 5-2 درصد استفاده می شود، از کربوهیدرات های دیگری نیز استفاده می شود. اینها شامل لاکتوز، گالاکتوز، مالتوز و نشاسته است و گزارش شده است که اثر کمتری نسبت به ساکارز یا گلوکز دارند، دومی به طور مشابه موثرتر از فروکتوز بود، با توجه به اینکه گلوکز در ابتدا توسط سلول ها و به دنبال آن فروکتوز استفاده می شد. اغلب نشان داده شد که ساکارز اتوکلاو شده برای رشد بهتر از ساکارز استریل شده فیلتر شده است. به نظر می رسد اتوکلاو ساکارز را به قندهای قابل استفاده تر مانند فروکتوز هیدرولیز می کند. گزارش شده است که ساکارز به عنوان محرک مورفوژنتیک در تشکیل جوانه های کمکی و انشعاب ریشه های فرعی عمل می کند. مشخص شد که مکمل های ملاس نیشکر، عصاره موز و آب نارگیل به محیط های پایه می تواند جایگزین خوبی برای کاهش هزینه های متوسط ​​باشد. این بسترها علاوه بر قندها، منابع ویتامین ها و یون های معدنی مورد نیاز برای رشد هستند.

3-1-4- ویتامین ها و میو اینوزیتول

برخی از گیاهان قادر به سنتز نیازهای ضروری ویتامین ها برای رشد خود هستند. برخی از ویتامین ها برای رشد و نمو طبیعی گیاهان مورد نیاز هستند، آنها به عنوان کاتالیزور در فرآیندهای متابولیکی مختلف مورد نیاز گیاهان هستند. زمانی که سلول‌ها و بافت‌های گیاهی Invitro رشد می‌کنند، ممکن است به عنوان عوامل محدودکننده رشد و تمایز سلول عمل کنند. ویتامین هایی که بیشتر در محیط کشت سلولی و بافتی استفاده می شوند عبارتند از: تیامین (B1)، اسید نیکوتینیک و پیریدوکسین (B6). تیامین لزوماً توسط همه سلول ها برای رشد مورد نیاز است. تیامین در غلظت های 0.1 تا 10 میلی گرم در لیتر استفاده می شود. نیکوتینیک اسید و پیریدوکسین، اگرچه برای رشد سلولی بسیاری از گونه ها ضروری نیستند، اغلب به محیط های کشت اضافه می شوند. اسید نیکوتینیک در محدوده غلظت 0.1-5 mg.l-1 و پیریدوکسین در 0.1-10 mg.l-1 استفاده می شود. سایر ویتامین‌ها مانند بیوتین، اسید فولیک، اسید اسکوربیک، اسید پانتوتنیک، توکوفرول (ویتامین E)، ریبوفلاوین، اسید p-آمینو بنزوئیک در برخی از محیط‌های کشت سلولی استفاده می‌شوند، اما عوامل محدودکننده رشد نیستند. توصیه می‌شود که ویتامین‌ها فقط زمانی به محیط‌های کشت اضافه شوند که غلظت تیامین کمتر از حد مطلوب باشد یا زمانی که سلول‌ها نیاز به رشد در تراکم جمعیت کم دارند. اگرچه این یک ویتامین نیست، بلکه یک کربوهیدرات است، میو اینوزیتول در مقادیر کم برای تحریک رشد سلولی اکثر گونه های گیاهی اضافه می شود. اعتقاد بر این است که میو اینوزیتول به دلیل تجزیه آن به اسید آسکوربیک و پکتین و ترکیب آن با فسفوئینوزیتیدها و فسفاتیدیل اینوزیتول در تقسیم سلولی نقش دارد. به طور کلی در محیط های کشت سلولی و بافتی گیاهی با غلظت 50-5000 میلی گرم در لیتر استفاده می شود.

3-1-5- آمینو اسید

اسیدهای آمینه مورد نیاز برای رشد بهینه معمولا توسط اکثر گیاهان سنتز می شوند، با این حال، افزودن اسیدهای آمینه خاص یا مخلوط اسیدهای آمینه برای ایجاد کشت سلول ها و پروتوپلاست ها اهمیت ویژه ای دارد. اسیدهای آمینه منبع نیتروژن را برای سلول های گیاهی فراهم می کنند که به راحتی توسط بافت ها و سلول ها سریعتر از منابع نیتروژن معدنی جذب می شود. مخلوط اسیدهای آمینه مانند هیدرولیز کازئین، ال-گلوتامین، ال-آسپارژین و آدنین اغلب به عنوان منابع نیتروژن آلی در محیط های کشت استفاده می شود. هیدرولیز کازئین به طور کلی در غلظت های بین 0.25-1 g.l-1 استفاده می شود. اسیدهای آمینه مورد استفاده برای افزایش رشد سلولی در محیط های کشت عبارتند از: گلیسین در 2 میلی گرم در لیتر، گلوتامین تا 8 میلی مولار، آسپاراژین در 100 میلی گرم در لیتر، ال-آرژنین و سیستئین در 10 میلی گرم در لیتر و ال-تیروزین در 100 میلی گرم در لیتر.

3-1-6- مکمل های ارگانیک تعریف نشده

برخی از محیط‌ها با مواد یا عصاره‌های طبیعی مانند هیدرولیز پروتئین، شیر نارگیل، عصاره مخمر، عصاره مالت، موز آسیاب شده، آب پرتقال و آب گوجه‌فرنگی تکمیل شدند تا تأثیر آنها بر افزایش رشد آزمایش شود. طیف گسترده ای از عصاره های آلی در حال حاضر معمولاً به محیط های کشت اضافه می شوند. افزودن زغال چوب فعال گاهی اوقات به محیط های کشت اضافه می شود که ممکن است اثر مفید یا مضر داشته باشد. رشد و تمایز در ارکیده، پیاز و هویج ، گوجه فرنگی تحریک شد. از سوی دیگر، با افزودن زغال چوب فعال به محیط کشت سویا، مهار رشد سلولی مشاهده شد. توضیح نحوه عملکرد زغال فعال بر اساس جذب ترکیبات بازدارنده از محیط، جذب تنظیم کننده های رشد از محیط کشت یا تیره شدن محیط بود. نشان داده شد که وجود 1 درصد زغال چوب فعال در محیط باعث افزایش هیدرولیز ساکارز در طول اتوکلاو می شود که باعث اسیدی شدن محیط کشت می شود.

3-1-7- مواد جامد کننده

سختی محیط کشت تا حد زیادی بر رشد بافت های کشت شده تأثیر می گذارد (شکل 1). تعدادی از عوامل ژل کننده مانند آگار، آگارز و صمغ ژلان وجود دارد.

محیط جامد شده با آگار از رشد گیاه حمایت می کند. آگار، پلی ساکارید به دست آمده از جلبک های دریایی، به عنوان یک عامل ژل کننده  مایع برای تهیه محیط های کشت بافت گیاهی نیمه جامد و جامد کاربرد جهانی دارد. آگار دارای چندین مزیت نسبت به سایر عوامل ژل کننده است. مخلوط آن با آب به راحتی در محدوده دمایی 60 تا 100 درجه سانتیگراد ذوب می شود و تقریباً در دمای 45 درجه سانتیگراد جامد می شود و ژلی پایدار در تمام دماهای مورد نظر برای رشد سلول ایجاد می کند. ژل آگار با مواد تشکیل دهنده محیط واکنش نشان نمی دهد و توسط آنزیم های گیاهی هضم نمی شود. معمولاً در محیط ها در غلظت های بین 0.8-1.0٪ استفاده می شود. آماده سازی آگار خالص به ویژه در آزمایشات مربوط به متابولیسم بافت از اهمیت بالایی برخوردار است.

3-1-8- تنظیم کننده های رشد

تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی در کشت بافت گیاهی مهم هستند زیرا نقش‌های حیاتی در ازدیاد طول ساقه، تروپیسم و ​​غالب شدن راس دارند. آنها به طور کلی در گروه های زیر طبقه بندی می شوند: اکسین ها، سیتوکینین ها، جیبرلین ها و اسید آبسیزیک. علاوه بر این، نسبت اکسین ها به سیتوکینین ها، نوع و میزان اندامزایی را در کشت های سلولی گیاهی تعیین می کند.

3-1-9- اکسین ها

اکسین های رایج مورد استفاده در محیط های کشت بافت گیاهی عبارتند از: ایندول-3- استیک اسید (IAA)، ایندول-3- بوتریکاسید (IBA)، 2،4-دی کلروفنوکسی استیک اسید (2،4-D) و نفتالین- استیک اسید(NAA).  IAA تنها اکسین طبیعی است که در بافت‌های گیاهی وجود دارد. اکسین‌های مصنوعی دیگری مانند 4-کلروفنوکسی استیک اسید یا p-کلرو-فنوکسی استیک اسید (4-CPA، pCPA)، 2،4،5-تری کلرو-2،4،5-تری کلرو- در محیط کشت استفاده می‌شوند. فنوکسی استیک اسید (2،4،5 T)، 3،6- دی کلرو-2- متوکسی- بنزوئیک اسید (دیکامبا) و 4- آمینو-3،5،6-تری کلرو-پیکولینیک اسید (پیکلورام). اکسین ها از نظر فعالیت فیزیولوژیکی و میزان انتقال آنها از طریق بافت و متابولیسم متفاوت هستند.

3-1-10- سیتوکینین ها

سیتوکینین‌هایی که معمولاً در محیط‌های کشت استفاده می‌شوند عبارتند از BAP (6-benzyloaminopurine)، 2iP (6-dimethylaminopurine)، کینتین (N-2-furanylmethyl-1H-purine-6-amine)، Zeatin (6-4-hydroxy-3-methyl-). trans-2-butenylaminopurine) و TDZ (thiazuron-N-phenyl-N-1،2،3 thiadiazol-5ylurea). زاتین و 2iP سیتوکینین های طبیعی هستند و زاتین موثرتر است. در محیط های کشت، سیتوکینین ها باعث تحریک تقسیم سلولی، القای تشکیل ساقه و تکثیر ساقه و تاخیر در تشکیل ریشه می شوند. سیتوکینین ها ترکیبات نسبتاً پایداری در محیط های کشت هستند و می توانند در دمای 20- درجه سانتیگراد خشک شده نگهداری شوند. اغلب گزارش شده است که سیتوکینین ها به سختی حل می شوند و گاهی اوقات افزودن چند قطره NHCl یا NaOH باعث تسهیل انحلال آنها می شود. سیتوکینین ها را می توان در مقادیر کمی از دی متیل سولفوکسید (DMSO) بدون آسیب به بافت گیاه حل کرد. DMSO یک مزیت اضافی دارد زیرا به عنوان یک عامل استریل کننده عمل می کند. بنابراین محلول های استوک حاوی DMSO را می توان مستقیماً به محیط کشت استریل اضافه کرد.

3-1-11- ژیبرلین ها

ژیبرلین ها بیش از بیست ترکیب دارند که GA3 پرمصرف ترین ژیبرلین است. این ترکیبات رشد کالوس را افزایش می دهند و به طویل شدن گیاهچه های کوتوله کمک می کنند. تنظیم‌کننده‌های رشد دیگری به عنوان اسید آبسیزیک به محیط‌های کشت بافت گیاهی اضافه می‌شوند، ترکیبی که معمولاً بسته به گونه برای مهار یا تحریک رشد کالوس مکمل می‌شود. این مکمل ها تکثیر ساقه را افزایش می دهد و مراحل بعدی رشد جنین را مهار می کند. اگرچه تنظیم‌کننده‌های رشد گران‌ترین مواد محیطی هستند، اما تأثیر کمی بر هزینه متوسط ​​دارند زیرا در غلظت‌های بسیار کم مورد نیاز هستند.

3-2- آماده سازی محیط

آماده سازی محیط کشت بهتر است در محفظه مجهز به این منظور انجام شود. این محفظه باید به گونه ای ساخته شود که نظافت را آسان کرده و احتمال آلودگی را کاهش دهد. منابع آب و گاز باید تامین شود. سیستم های مناسب برای استریلیزاسیون یا یونیزاسیون آب نیز مهم هستند. برای عملکرد بهتر دستگاه های خاصی مانند یخچال، فریزر، هات پلیت، همزن، PH متر، ترازوی الکتریکی با محدوده وزنی مختلف، بخاری، مشعل Bunsen علاوه بر ظروف شیشه ای و مواد شیمیایی مورد نیاز هستند. اکنون به خوبی می دانیم اشتباهاتی که در فرآیند کشت بافت رخ می دهد اغلب ناشی از تهیه نادرست محیط هستند، به همین دلیل است که ظروف شیشه ای تمیز، آب با کیفیت بالا، مواد شیمیایی خالص و اندازه گیری دقیق اجزای محیط باید تسهیل شود.

3-3- انتخاب محیط

برای ایجاد یک پروتکل جدید برای یک هدف خاص در کشت بافت، یک محیط مناسب بهتر است با آزمایش افزودن جداگانه یک سری از غلظت‌های یک ترکیب معین به یک محیط پایه جهانی مانند MS، LS یا B5 فرموله شود. موثرترین متغیرها در محیط های کشت بافت گیاهی تنظیم کننده های رشد به ویژه اکسین ها و سیتوکینین ها هستند. استحکام کامل نمک در محیط برای چندین گونه خوب بود، اما در برخی گونه ها کاهش سطح نمک به ½ یا ¼ غلظت کامل نتایج بهتری را در رشد آزمایشگاهی به همراه داشت. اغلب فرض می شود که ساکارز بهترین منبع کربن برای کشت آزمایشگاهی است، سطوح مورد استفاده از 2 تا 6 درصد است و سطح آن باید برای هر گونه تعریف شود.

3-4- استریل سازی محیط ها

پیشگیری از آلودگی محیط های کشت بافت برای کل فرآیند تکثیر گیاه مهم است و به کاهش انتشار انگل های گیاهی کمک می کند. آلودگی محیط را می توان با افزودن عوامل ضد میکروبی، اسیدی کردن یا با فیلتر کردن از طریق فیلترهای ریز متخلخل کنترل کرد. برای کاهش احتمال آلودگی، توصیه می‌شود که اتاق‌های استریلیزاسیون کمترین تعداد دهانه را داشته باشند. آماده سازی و استریل کردن محیط ترجیح داده می شود در محفظه های جداگانه انجام شود. محل استریلیزاسیون نیز باید دارای دیوارها و کفی باشد که در برابر رطوبت، گرما و بخار مقاومت کند. استریل کردن محیط به طور معمول با اتوکلاو کردن در دمای بین 115 تا 135 درجه سانتیگراد انجام می شود. مزایای اتوکلاو عبارتند از: روش سریع و ساده است، در حالی که معایب آن تغییرات pH محیط است و ممکن است برخی از اجزاء تجزیه شوند و در نتیجه کارایی آنها از بین برود. به عنوان مثال مخلوط اتوکلاو فروکتوز، گلوکز و ساکارز منجر به کاهش ظرفیت ژل شدن آگار و تأثیر بر pH محیط کشت از طریق تشکیل مشتقات فورفورال به دلیل هیدرولیز ساکارز شد. فیلتراسیون از طریق فیلترهای میکروپوروس (0.22-0.45) همچنین برای ترکیبات آلی حساس به حرارت مانند ویتامین ها، تنظیم کننده های رشد و اسیدهای آمینه استفاده می شود. افزودنی های عوامل ضد میکروبی کمتر در محیط های کشت بافت گیاهی استفاده می شوند. محدودیت برای استفاده از آنها گزارش شد و به آسیب های وارد شده به گیاهان نیز نسبت داده شد.

در ادامه مهمترین محیط کشت های مورد استفاده در کشت گیاهی را معرفی میکنیم:

1.    Murashige and Skoog medium (MS)

2.    Linsmaier and Skoog medium (LS)

3.    Gamborg medium (B5)

4.    Nitsch and Nitsch medium (NN)

5.    White’s Medium

6.    Quoirin & Lepoivre medium (QL)

به منظور خرید محیط کشت های گیاهی بر روی اینجا کلیک کنید

 

جهت درخواست هرگونه مشاوره و راهنمایی با کارشناسان شرکت کیاژن فناور تماس حاصل بفرمایید.