توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

توالی یابی کل اگزوم

توالی یابی اگزوم، همچنین به عنوان توالی یابی کل اگزوم (WES) شناخته می شود، یک تکنیک ژنومی برای تعیین توالی تمام مناطق کدکننده پروتئین ژن در یک ژنوم (معروف به اگزوم) است. این امر شامل دو مرحله است: مرحله اول انتخاب تنها زیرمجموعه DNA است که پروتئین ها را کد می کند. این مناطق به عنوان اگزون شناخته می شوند – انسان حدود 180000 اگزون دارد که حدود 1٪ از ژنوم انسان یا تقریباً 30 میلیون جفت باز را تشکیل می دهد. مرحله دوم تعیین توالی DNA اگزونیک با استفاده از هر فناوری توالی یابی DNA با توان عملیاتی بالا می‌باشد.

توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing با استفاده از غنی سازی اگزوم می تواند به طور موثر انواع کدگذاری را در طیف وسیعی از کاربردها، از جمله ژنتیک جمعیت، بیماری های ژنتیکی و مطالعات سرطان شناسایی کند.

هدف این رویکرد شناسایی واریانت‌های ژنتیکی است که توالی پروتئین را تغییر می‌دهند و این کار را با هزینه بسیار کمتری نسبت به توالی‌یابی کل ژنوم انجام می‌شود. از آنجایی که این گونه‌ها می‌توانند هم مسئول بیماری‌های مندل و هم بیماری‌های چند ژنی رایج مانند بیماری آلزایمر باشند، توالی‌یابی کل اگزوم هم در تحقیقات دانشگاهی و هم به‌عنوان یک تشخیص بالینی استفاده شده است.

توالی یابی اگزوم اکنون به طور فزاینده ای برای تکمیل آزمایش ها مورد استفاده قرار می گیرد: هم برای یافتن جهش در ژن هایی که قبلاً عامل بیماری هستند و هم برای شناسایی ژن های جدید با مقایسه اگزوم های بیماران با ویژگی های مشابه.

اگزوم معمولاً به عنوان دنباله‌ای تعریف می‌شود که تمام اگزون‌های ژن‌های کدکننده پروتئین و همچنین عناصر کدکننده غیرپروتئینی مانند microRNA یا lncRNA را در بر می‌گیرد. بررسی اگزوم کمک می کند تا بفهمیم کدام جایگاه ها مسئول بیماری های مناسب هستند. زمانی که محققان قصد دارند اطلاعات اگزون ژنوم انسان را کشف کنند، هزینه توالی‌یابی کل ژنوم با در نظر گرفتن طول کل ژنوم انسان بیش از 3 میلیارد جفت باز در اندازه بسیار شگفت‌انگیز خواهد بود. برای مطالعه بیماری های نادر مندلی، توالی اگزوم روش موثرتری برای شناسایی واریانت های ژنتیکی است. پیشرفت استراتژی های غنی سازی هدف و تکنیک های توالی یابی DNA به توسعه توالی یابی کل اگزوم کمک می کند.

مزایای توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

انواع مختلف را در طیف گسترده ای از برنامه ها شناسایی می کند.

پوشش مناسبی از مناطقی که پروتئین ها را کد می‌کنند، دارد.

یک جایگزین مقرون‌ به ‌صرفه برای توالی‌یابی کل ژنوم ارائه می‌دهد (4 تا 5 گیگابیت توالی‌یابی در هر اگزوم در مقایسه با 90 گیگابیت برای هر ژنوم کامل انسان)

مجموعه داده‌های کوچک‌تر و قابل مدیریت‌تری برای تجزیه و تحلیل داده‌های سریع‌تر و آسان‌تر در مقایسه با رویکردهای کل ژنوم تولید می‌کند.

تجزیه و تحلیل کارآمد مناطق کدگذاری در توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

زمانی که توالی یابی کل ژنوم عملی یا ضروری نباشد، توالی یابی اگزوم یک رویکرد مقرون به صرفه است. توالی‌یابی تنها مناطق کدکننده ژنوم، محققان را قادر می‌سازد تا منابع خود را بر روی ژن‌هایی متمرکز کنند که احتمالاً روی فنوتیپ تأثیر می‌گذارند و ترکیبی در دسترس از زمان و قیمت ارائه می‌دهد.

کتابخانه های DNA را می توان در کمتر از 1 روز آماده کرد و تنها به 4-5 گیگابایت توالی یابی در هر اگزوم نیاز دارد. توالی یابی اگزوم انواعی را در اگزون های کدگذاری تشخیص می دهند که قابلیت گسترش محتوای هدفمند شامل مناطق ترجمه نشده UTRs و microRNA را جهت دید جامع تر از تنظیم ژن، ارائه می‌دهد.

اصل توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

توالی یابی اگزوم شامل دو فرآیند اصلی، یعنی غنی سازی هدف و توالی یابی است. غنی‌سازی هدف، انتخاب و گرفتن اگزوم از نمونه‌های DNA است. دو روش عمده برای دستیابی به غنی سازی اگزوم وجود دارد.

• غنی‌سازی اگزوم مبتنی بر آرایه از پروب‌های متصل به ریزآرایه‌هایی با چگالی بالا برای دست یافتن به اگزوم استفاده می‌کند. ریزآرایه یک آرایه دو بعدی روی اسلاید شیشه ای یا لایه نازک سیلیکونی است که حاوی الیگونوکلئوتیدهای مکمل برای بخش های ژنوم هدف است. در حالی که نمونه های تکه تکه شده DNA از طریق ریزآرایه جریان می یابند، اثر جفت شدن مکمل باعث اتصال اگزوم در ریزآرایه می شود و سایر قسمت های ژنوم تجزیه می شوند که منجر به جدا شدن اگزوم از سایر قسمت های ژنوم می شود.
• جذب در املاح بر اساس مهره مغناطیسی است. مهره مغناطیسی نوعی نانوذرات مغناطیسی است که حاوی اجزای شیمیایی کاربردی برای ترکیب مواد هدف است. در این مورد از مهره های مغناطیسی که می توانند اگزوم را متصل کنند استفاده می شود. سپس داستان با روش مبتنی بر آرایه یکسان است، اگزوم جذب می شود و به دانه های مغناطیسی متصل می شود، سپس با سایر قسمت های ژنوم تجزیه می شود. مزیت روش جذب املاح این است که استفاده از مهره مغناطیسی باعث می شود که واکنش با تکان دادن یا گرم کردن سیستم موثرتر می‌باشد.

هر دوی این روش ها روش های موثری برای استخراج اگزوم از ژنوم هستند. بنابراین می گوییم حساسیت هر دو به اندازه کافی بالاست. با این حال، مشکل ویژگی خاص است. بخش هایی از ژنوم وجود دارد که توالی مشابهی با برخی اگزون ها دارند. آن قسمت‌های ژنوم ممکن است به ریزآرایه یا دانه‌های مغناطیسی متصل شوند و در نتیجه مثبت کاذب باشند.

توالی یابی فرآیندی است برای کشف آرایش تمام دئوکسی ریبونوکلئوتیدها در اگزوم، که ممکن است به ما در درک تناوب بالقوه پاتوفیزیولوژی در برخی بیماری ها کمک کند. به دلیل کاهش هزینه، اهمیت توالی یابی کل اگزوم برجسته است. هزینه ژنوم انسان تقریباً معادل دو یا سه برابر هزینه توالی یابی کل اگزوم است

روش کار عمومی توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

در اینجا یک چارت رایج از توالی اگزوم نشان داده شده است که در ادامه به توضیح آن می‌پردازیم.

توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

• نمونه های DNA خود را آماده کنید: قطعه قطعه شدن DNA

تقریباً تمام آزمایشات روی DNA با قطعه قطعه شدن DNA آغاز می شود. DNA باید به قطعات مناسب برش داده شود، زیرا معمولاً طول نمونه DNA استخراج شده از بافت ها یا سلول ها بسیار طولانی است. این فرآیند برش قطعه قطعه شدن DNA نامیده می شود. طول هدف موثر با ابزار توالی یابی که انتخاب می کنید تعیین می شود. به منظور پردازش توالی اگزوم کل، چندین راه اصلی برای قطعه قطعه کردن نمونه های DNA وجود دارد.

تکه تکه شدن فیزیکی قطعه قطعه شدن فیزیکی شامل برش صوتی، فراصوت و برش هیدرودینامیکی است. در میان آنها برش صوتی و سونیکاسیون روش های اصلی برای قطعه قطعه شدن DNA هستند. نمونه‌های DNA به دلیل کاویتاسیون آکوستیک (acoustic cavitation) و برش هیدرودینامیکی هنگام قرار گرفتن در معرض سونوگرافی به چند قطعه شکسته می‌شوند.

روش های آنزیمی آنزیم هایی که برای شکستن DNA به قطعات کوچک استفاده می شوند شامل نوکلئاز یا ترانسپوزاز هستند. نوکلئاز پیوندهای فسفودی استری بین اسیدهای نوکلئیک را می شکند و در نتیجه DNA تجزیه می شود. به طور خاص، اندونوکلئاز محدود، DNA را در مکان‌های محدود می‌شکند. ترانسپوزاز برای میانجیگری رویدادهای جابجایی استفاده می شود، فرآیندهایی که بخش خاصی از DNA می تواند در اطراف کروموزوم حرکت کند. اگر نمونه های DNA و ترانسپوزاز مناسب را تهیه کنیم، در قطعه قطعه شدن DNA نیز نقش دارد. DNA تکه تکه شده به جای قرار دادن دوباره با آداپتورها مرتبط می شود و در نتیجه قطعه قطعه می شود.

پس از تکه تکه شدن، نمونه های DNA شما برای فرآیند غنی سازی هدف آماده است.

• جداسازی اگزوم: روش های غنی سازی هدف

اگزوم باید قبل از تعیین توالی از ژنوم انسان جدا شود زیرا تنها در 1٪ از ژنوم نقش دارد. فرآیند دست‌یابی به مناطق ژنومی هدف را، غنی سازی هدف می نامند. ایده اصلی غنی‌سازی هدف، جداسازی هر چیز مورد علاقه از سایر مواد با استفاده از تفاوت خواص فیزیکوشیمیایی بین آنهاست. برخی از کیت های متداول روش های غنی سازی هدف وجود دارد. مهم نیست چه کیتی را انتخاب می کنید، تنوع در به دست آوردن توالی اگزوم شما تأثیر می گذارد، بنابراین از کیفیت، کمیت و اندازه قطعات نمونه های DNA خود آگاه باشید.

• محصولات خود را برداشت کنید: شست و شو و جمع آوری نمونه

پس از جداسازی اگزوم و سایر قسمت های ژنوم، چندین بار شستشو لازم است. فرآیند شستشو دقیقاً مانند معنای واقعی کلمه است – شستن هر چیزی که نمی خواهیم تا چیز مورد علاقه را حفظ کنیم. در این صورت ما موادی مانند سایر قسمت های ژنوم، پروتئین ها و الکترولیت ها را نمی خواهیم. معمولاً از آب مقطر برای شستشوی هدف استفاده می شود، اما برخی از کیت های معرف خاص ممکن است به شوینده خاصی نیاز داشته باشند. شوینده معرف برای شستن اگزوم از ریزآرایه یا دانه های مغناطیسی است که می تواند ارتباط بین اگزوم و مواد اتصال دهنده را قطع کند. هر دو فرآیند شستشو وجمع‌آوری نمونه می توانند چندین بار پردازش شوند تا اگزوم های خالص تر به دست آید. همچنین در برخی موارد، یک فرآیند غنی‌سازی هدف دیگر برای بهتر کردن شستشو انجام می‌شود. فقط دستورالعمل کیت معرف مورد استفاده خود را دنبال کنید و پروتکل خود را با توجه به وضعیت واقعی خود تنظیم کنید.

• تکنولوژی توالی یابی در توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

به دلیل هزینه زمانی و طول مورد نیاز توالی یابی سنگر، فناوری توالی یابی در مطالعات بیولوژیکی و بالینی کمک چندانی نکرد تا اینکه فناوری های توالی یابی نسل بعدی NGS اختراع شدند. فناوری‌های NGS مبتنی بر استفاده از ddNTP‌های رنگ‌شده در روش سنگر هستند. پیشرفت این است که NGS امکان ترکیب، تقویت و شناسایی همزمان رشته‌های DNA را می‌دهد که منجر به افزایش نیازبه طول و افزایش کارایی توالی‌یابی می‌شود. برای ساده‌تر کردن، اصل NGS این است که نمونه‌های اگزوم را در یک پایه مناسب متصل باشند و آنها را با PCR-in-situ تکثیر ‌کنند تا در هر دور سیگنال ایجاد شود. افزایش ازدیاد طول سپس ddNTP ها پس از هر دور موجب افزایش طول شناسایی می شوند. در نهایت، توالی کامل با استفاده از الگوریتم اطلاعات بیولوژیکی یکپارچه می‌شود. NGS تا حد زیادی کارایی را بهبود می‌بخشد و امکان تشخیص بازده بالاتر را می‌دهد، به همین دلیل است که NGS را توالی با توان بالا نیز می‌نامند و به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرد.

علاوه بر NGS، نسل سوم توالی یابی به سرعت در حال توسعه است که تا حد زیادی از کارایی NGS فراتر می رود. ویژگی کلیدی توالی یابی نسل سوم، توالی یابی تک مولکولی است. هزینه زمانی توالی یابی کل ژنوم را به چند دقیقه کاهش می دهد.

• تحلیل داده ها در توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing

داده های توالی یابی قبل از تجزیه و تحلیل و تفسیر بیوانفورماتیک گیج کننده و غیرقابل خواندن هستند، زیرا اکثر روش های توالی یابی قطعات کوتاهی از توالی را تولید می کنند که برای تعیین نتیجه نهایی نیاز به مونتاژ توالی دارد. از چارت زیر می تواند توسط محققانی که علاقه مند به انجام تجزیه و تحلیل WES برای فراخوانی انواع و بیماری های ژنتیکی هستند استفاده شود.

پیشننهاد می‌شود که از استراتژی فیلتر کردن داده اگزوم بهره گرفته شود. به این صورت که استراتژی فیلترینگ پیشنهادی با کنترل کیفیت و حذف انواع کم کیفیت آغاز می شود. فنوتیپ عمیق و به اشتراک گذاری اطلاعات بالینی دقیق به بهترین وجه از انتخاب لیست های ژن کاندید از پایگاه های اطلاعاتی و تحقیقات منتشر شده می‌باشد. اگر اطلاعات جدیدی در دسترس قرار گیرد، فهرست ژن می تواند تجدید نظر شود، و داده ها به طور مکرر در طول زمان تجزیه و تحلیل شوند. شواهدی مبنی بر ارتباط بیماری-ژن جدید به تحقیقات اضافه می‌شود و در پایگاه‌های اطلاعاتی بیماری‌ها نگهداری می‌شود و مخزن ژن‌های کاندید را افزایش می‌دهد. داده های اگزوم با فیلتر اولیه کاهش می یابد. اگر هیچ کاندید مناسبی شناسایی نشد، تجزیه و تحلیل تفکیک را می توان گسترش داد تا آلل های غیر نافذ (کاندیداهای پاس دوم) را شامل شود و تحت فیلتر ثانویه قرار گیرد. یک گزارش اگزوم حاوی لیستی از انواع اولویت بندی شده گردآوری شده است.

نتیجه‌گیری

ما از توالی اگزوم هم در تحقیقات دانشگاهی و هم در تشخیص کلینیکی سود زیادی برده ایم. به لطف توالی یابی اگزوم، درک ژنوم به سطح جدیدی توسعه یافته است. بسیاری از بیماری ها در گذشته معمایی بودند، مانند اختلالات عصبی در نوزادان، که اکنون قابل پیش بینی است. علاوه بر این، بسیاری از بیماری‌ها با درمان‌های اندک، مانند کارسینوما، مجاز به درمان با درمان هدفمند هستند. گفته می شود که نسل چهارم فناوری توالی یابی در حال توسعه است. امیدوارم که انقلاب دیگری در تحقیقات بیولوژیکی و پزشکی ایجاد کند.

توالی یابی کامل اگزوم | Whole Exome Sequencing